[01050296]广西产鸡蛋花抑制α-葡萄糖苷酶物质基础研究

1.项目来源与背景：(1)糖尿病发病率高、危害严重，从传统民族药用植物中寻找抗糖尿病天然活性成分具可行性和必要性。糖尿病是威胁全球人类健康和造成病人死亡的最主要的非传染性疾病之一，根据国际糖尿病联盟(IDF)官方统计，截止2015年，全球罹患该病的成年人高达4.15亿，并预计到2040年全球10％(约6.42亿)的人口将患上糖尿病。随着经济高速发展和工业化进程的推进，生活方式的快速改变和老龄化进程的加速，糖尿病已成为中国主要的公共健康问题。2015年，中国治疗糖尿病及与其密切相关的如中风、心力衰竭、肾病、视力损伤等疾病的支出费用约为510亿美元，仅次于美国(约3200亿美元)。因此，预防和治疗糖尿病已成为解决中国人民健康问题的战略需要。根据糖尿病发病机理和治疗靶标的不同，用于治疗T2DM的药物日益多样化，随着用药个体数量和药物使用年限的增加，一些药物的副作用不断被发现并见诸报道，如PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类曲格列酮(troglitazone)因其肝毒性而从美国市场撤离；吡格列酮(pioglitazone)虽然可以减少糖耐量受损转化成T2DM，但会伴随着显著的体重增加和水肿，且服用2年会增加膀胱癌的风险。值得注意的是，上述退市或有毒副作用的药物都是化学合成药物，而前体来源于欧洲传统民间药用豆科植物山羊豆(Galega officinalis)的二甲双胍(metformin)早在1957年就已上市，因其副作用少，价格适中而被美国和欧洲糖尿病协会推荐为一线用药和药物联合中的基本用药。与上述化学合成药物不同的是，二甲双胍不会引起低血糖和体重增加、不会增加患癌风险，而是否会对糖尿病病人造成乳酸酸中毒尚不确定。因此，从传统民族药用植物中发现高效治疗糖尿病的活性分子具可行性，是新药发现的有效途径之一。(2)文献调研广西道地药材鸡蛋花在治疗糖尿病方面表现出良好的潜质，但其物质基础和作用方式尚不明确，值得深入研究。文献研究表明，鸡蛋花提取物具有降糖活性，但其物质基础和作用机制尚不明确。Viswanathan等认为，鸡蛋花叶的含水醇提物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血糖有明显的改善作用，John Merina等认为，鸡蛋花茎皮中的黄酮苷能显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病的血清甘油三酯水平，但对血清胆固醇和血清葡萄糖水平没有影响。因此，对鸡蛋花抗糖尿病的物质基础和可能的作用方式进行深入研究，是完全必要和可行的。(3)环烯醚萜苷类化合物也是有效的α-葡萄糖酶抑制剂，鸡蛋花中富含该类成分的苷元，从该植物中发现高效的具降糖活性的该类抑制剂具有科学性和可行性。环烯醚萜类化合物是不规则的单萜类化合物，其结构母核通过碳-碳键骈合甲基环戊烷和吡喃环。该类成分主要分布于夹竹桃科、龙胆科(Gentianaceae)、马钱科(Loganiaceae)和茜草科(Rubiaceae)等科别中。其中，在夹竹桃科的鸡蛋花属(Plumeria)、海杧果属(Cerbera)和黄婵花属(Allamanda)等植物含量相对较高。研究表明，环烯醚萜及其苷具有明显的降糖活性。 2.技术原理及性能指标：化合物的分离和鉴定：运用正相、反相、高效液相及Sephadex LH-20凝胶柱色谱等方法分离纯化化合物，经光谱方法，结合理化性质及文献报道鉴定化合物结构。Α-葡萄糖苷酶抑制活性：精密称取一定量的α-葡萄糖苷酶于容量瓶中，加蒸馏水定容得到α-葡萄糖苷酶溶液，再将α-葡萄糖苷酶溶液稀释并置于4oC冰箱备用。在96孔板中先加入样品和Tris-HCl缓冲液，再加入α-葡萄糖苷酶，并在25oC恒温孵育箱孵育10min后，加入50μL4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，25oC反应5min。在405nm处测定吸光度(A)值，每个样品平行测3次，以阿卡波糖作为阳性对照。采用SPSS18.0进行统计分析，结果表示为平均值±标准偏差。PTP1B抑制活性评价：测试样品在20μg/ml浓度下的抑制活性，采用光吸收检测法，在384孔平底透明微孔板中检测酶活性。底物pNPP经PTP1B水解得到的游离产物在405nm处有很强的光吸收。通过酶标仪监测405nm处光吸收强度的变化，计算得到反应初速度。实验中采用的对照化合物为齐墩果酸。样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。采用光吸收检测法，在384孔平底透明微孔板中检测酶活性。底物pNPP经PTP1B水解得到的游离产物在405nm处有很强的光吸收。通过酶标仪监测405nm处光吸收强度的变化，计算得到反应初速度。实验中采用的对照化合物为齐墩果酸。样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。 3.应用情况：该项目的研究成果主要通过以下途径进行传播：(1)在不同层次(本科、高职)和不同专业(药学、药物制剂、临床药学)的课堂教学中，适当引用和讲解该项目的科研过程和成果，以培养学生对科学研究的兴趣，了解科研的艰辛与乐趣。(2)同时，将该项目实施的各个环节，如样品采集、提取，有效成分的分离和纯化，化合物结构鉴定及活性测定，与本人承担的课程《天然药物化学》和《新药研究与开发》相应的内容结合起来，使学生做到理论与实践结合，对于巩固教学效果，改革教学方式等都大有益处。