[01098527]新一代丙烯酰胺生产菌株的开发及应用

腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化相应的酰胺类化合物的金属酶，工业上利用其催化丙烯腈转化为丙烯酰胺。该生物法制备丙烯酰胺工艺在1985年被开发，是生物法替代化学法的典型案例，目前使用的菌株是1991年开发的含有腈水合酶的红球菌J1。由于腈水合酶热稳定性不高、对底物(腈类有机物)和产物(酰胺类有机物)的耐受性差，且红球菌J1培养条件要求高，培养时间长，因此生物法比化学法的优势越来越不明显，已经成为当前生物法生产丙烯酰胺的突出问题。近几年来，在国家以及省部级科技计划的资助下，课题组对腈水合酶的理化性质、生物合成机制、翻译后的成熟机制进行研究，发现了影响腈水合酶活性与稳定性的关键蛋白，并以此为基础通过蛋白质工程技术提升腈水合酶催化性能，开发出了新一代具有高催化性能的基因工程菌。该项技术菌株培养方法简单，有效提升生物催化法生产丙烯酰胺的产业化效率，降低了生产成本，提高了中国酶催化法生产丙烯酰胺的工业水平，增强国际市场竞争力；推动生物法代替化学法生产丙烯酰胺的进程，对环境保护具有重要意义。 主要技术内容如下：(1)对解析钴型腈水合酶生物合成机制进行解析，发现了影响腈水合酶活性与稳定性的关键蛋白。在对红球菌J1菌的低分子量型腈水合酶(L-NHase)的合成机理的研究过程中，发现了一种全新的蛋白质翻译后活性化体系，命名为亚基自身交换机制(self-subunit swapping)，并且发现亚基自身交换机制具有一定的普遍性，也存在于其它生物酶中。发现了一类具有特殊机能的新型蛋白质，命名为亚基自身交换伴随子(又称调控亚基)。这种蛋白有亚基交换、金属伴随子、半胱氨酸的氧化修饰等机能，该蛋白的C端结构域的高度柔性对腈水合酶钴离子获取有重要作用，对腈水合酶的活性与稳定性起关键作用。(2)通过蛋白质工程技术改造，提升腈水合酶催化性能。利用蛋白质杂化融合技术构建由不同来源腈水合酶的结构域片段拼接组合而成的新酶，具有更强的热稳定性，且活性不受影响；在腈水合酶上融合自组装肽，通过分子间静电吸引形成了高聚物，显著地提升酶蛋白的热稳定性；构建融合了腈水性。(3)以理论研究为基础，开发出高效表达腈水合酶的基因工程菌，建立并优化了高密度发酵工艺。相比较现在的工业用生产丙烯酰胺的红球菌J1，发酵周期缩短了50％，而且基因工程菌培养基要求更简单，操作更方便。实现了丙烯酰胺生产菌株的更新换代，降低了生产成本，极大的提高了经济效益。 该成果授权国家发明专利4项、授权国际发明专利1项；发表SCI论文17篇；该项成果被Current Opinion in ChemicalBiology和Biotechnology Advances等国际知名期刊进行了详细报道。该项目技术成果已经在江苏如东南天农科化工有限公司(国内丙烯酰胺最大企业)实现产业化，降低生产成本20％，提高生产效率30％，新增销售额102850万元，利润3804万元。丙烯酰胺产品市场占有率达到38.6％。