[01121105]旨在增强力达霉素抗肿瘤活性的靶向性融合蛋白的分子设计及抗肿瘤活性研究

力达霉素（Lidamycin, LDM）是由本项目合作完成单位自主开发的一种烯二炔类抗生素,研究显示它对多种肿瘤细胞均具有强烈的杀伤活性,其杀伤活性比常用的化疗药物阿霉素、丝裂霉素等高10,000倍。在动物模型中LDM对多种类型的移植瘤也具有显著的生长抑制活性,目前该药已进入II期临床试验。尽管具有强烈的抗肿瘤活性,但LDM仍属于一种细胞毒类药物,其对正常组织也具有一定的毒性。为了进一步提高其抗肿瘤活性,降低其毒副作用,本项目设计了4种融合蛋白,以针对肿瘤组织中特异性高表达分子的抗体、配体或寡肽作为导向载体,以LDM作为“弹头”药物,通过载体的导向作用,将高毒性的LDM分子运送到肿瘤细胞,使得肿瘤局部药物浓度大大提高,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。 （1）双特异性融合蛋白Ec-Hr-LDP-AE：研究显示表皮生长因子受体（EGFR）家族在肺癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌等多种肿瘤中过量表达,本项目以该家族的两个成员EGFR和HER2为作用靶点,以EGFR和HER2的特异性寡肽作为导向载体,以力达霉素作为效应分子构建了一种双特异性的烯二炔强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE。体外实验结果显示,该融合蛋白对高表达EGFR和HER2的表皮癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞具有十分强烈的杀伤活性,其IC50值在10-12mol/L-10-14mol/L之间,且其杀伤活性要高于LDM和两种单靶点融合蛋白Ec-LDP –AE和LDP-Hr-AE。体内实验结果显示,该融合蛋白对人卵巢癌裸鼠移植瘤具有显著的生长抑制活性,在0.3、0.4和0.5 mg/kg的剂量下,其抑瘤率分别为64.7%、79.5 %和91.3%,其中0.5 mg/kg剂量组与LDM处理组（抑瘤率为65.6%）有显著性差异。在相同剂量下,双特异性Ec-LDP-Hr-AE蛋白同样表现出了比单靶点的Ec-LDP-AE、LDP-Hr-AE蛋白更强的抑制肿瘤生长的作用。 （2）双特异性融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE：表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体I（IGF-IR）在人非小细胞肺癌（NSCLC）和食管癌中呈过表达状态,且二者之间可发生多种形式的相互作用。本项目以EGFR和IGF-1R的天然配体EGF和IGF-1作为导向载体,以LDM作为“弹头”药物,构建了另一种全新的双特异性融合蛋白EGF-IGF-LDP-AE。抗肿瘤活性评价实验显示,构建的双特异性融合蛋白EGF-IGF-LDP-AE对非小细胞肺癌和食管癌具有强烈的体内、外抗肿瘤活性,其抗肿瘤活性要远高于LDM和两种单靶点融合蛋白EGF-LDP-AE和LDP-IGF-AE,并阐明了双特异性融合蛋白抗非小细胞肺癌和食管癌的分子机制。 （3）融合蛋白dFv-LDP-AE和dFv-R-LDP-AE：明胶酶（基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-4）在肿瘤的侵袭转移及肿瘤血管生成过程中发挥重要作用,在多种肿瘤中均表达升高。我们设计了一种以明胶酶为靶点的融合蛋白dFv-LDP和其烯二炔强化融合蛋白dFv-LDP-AE,该融合蛋白由两个串联的抗明胶酶单链抗体和LDM分子连接而成。经检测dFv-LDP和dFv-LDP-AE在肺癌PG-BE1移植瘤模型中表现出了非常强烈的抗肿瘤活性,且将dFv-LDP和dFv-LDP-AE联用后,抑瘤效应进一步提高。小动物活体成像结果显示融合蛋白dFv-LDP在多种裸鼠异位移植瘤中都具有良好的靶向作用。在此基础上,针对dFv-LDP不能被肿瘤细胞有效内化的缺点,我们其对进行了分子改造,在dFv和LDP之间引入了九聚谷氨酸（Arg）9序列,构建了另一种融合蛋白dFv-R-LDP-AE。相较于dFv-LDP-AE,（Arg）9的引入增加了融合蛋白对胰腺癌细胞SW-1990和PANC-1的穿膜效率,而且表现出了显著的体内外抗胰腺癌效应。 本项目获得的成果如下：构建了四种不同的融合蛋白,获得国家发明专利2项,发表SCI论文9篇,其中JCR一区论文2篇,二区论文1篇,发表中文核心期刊论文4篇。