[01127474]通过代谢途径中关键酶的定向进化调控微生物代谢网络的基础研究

谷氨酸脱羧酶（以下简称 GAD）在细胞中具有更重要和普遍的生理功能,具有重要的研究意义。本成果建立了一种基于显色反应对 GAD 进行高通量筛选的方法。然后通过同源建模对 GAD 的三维结构进行了预测和分析,并通过分析酶的结构和功能关系,提出了一个解释酶催化活力受 pH 调控的机理假说,并基于这一假说设计了酶的半理性改造方案,在高通量筛选方法的帮助下,成功地改变了酶活性受 pH 调控的性质。此外,还采用分子动力学模拟方法对 GAD 上各氨基酸残基对 GAD 热稳定性的影响进行了分析,并通过分子设计方法,获得了两个热稳定性得到显著增强的 GAD 突变酶。对于所获得的这些突变酶进行了序列和结构分析,预测了突变酶的高级结构,分析了酶的结构－活性－活性调控三者间的关系,解读了酶的活性调节性质发生改变的机理,并在大肠杆菌中考察了酶活性调控性质改变对微生物代谢网络的影响。研究成果不仅丰富了对 GAD 的结构－功能关系的认识,也为进一步研究与酶活力的 pH 调控性质相关的结构－功能关系提供了指导。