[01187535]高效苜蓿根瘤工程菌的环境安全性及其应用基础研究

从保存的土著根瘤菌中筛选出一株结瘤固氮性能最佳的菌株，作为构建工程菌的出发菌；将中华苜蓿根瘤菌的nifA 基因插入质粒pKT230，构建了组成型表达重组质粒；利用三亲本杂交技术将pXL1转入土著菌中，构建了苜蓿根瘤工程菌，并通过盆栽及小区试验比较了工程菌与出发菌的结瘤固氮性能的差异。在微宇宙体系中栽培苜蓿，分离苜蓿根系及根际微生物；并分离小区试验中苜蓿根系际根际微生物，对得到的菌株通过抗性平板筛选、Sm nifA 基因探针杂交、RAPD 分析、PCR 扩增，没有发现重组质粒的转移；提取接种工程菌的苜蓿的根、茎、叶总DNA，以Sm nifA 基因为探针进行Southern 杂交，没有得到杂交信号；制备了苜蓿根瘤工程菌、紫云英根瘤菌、大豆根瘤菌、不同的土著苜蓿根瘤菌的抗血清，检测了重组质粒在根瘤菌间的转移，未检测到转移情况；从小区周围的土壤中分离土壤微生物，通过抗性平板筛选、抗血清检测，未见工程菌的转移；在室内栽培苜蓿，设置不同的施肥量，工程菌受抑制的情况远小于出发菌；提取苜蓿根系土壤微生物总DNA，PCR－DGGE 技术分析表明工程菌对土壤细菌群落有影响。确定了工程菌的发酵工艺及菌剂剂型。