[01187941]木豆特促进成骨细胞增殖特异内生真菌G6和Y3的鉴定及其活性代谢产物研究

1、课题来源与背景 木豆（Cajanus cajan） 为豆科木豆属一年生或多年生木本植物,主要分布于热带和亚热带地区,在我国仅分布于部分南方省区,药用价值极高（Rinthong, 2018）。木豆根、茎、叶、花、荚和种子均可入药,以叶的药用功效最为显著,具有治疗烧伤、外伤、褥疮、肝炎、结石等（孙绍美, 1995）。木豆叶水提取物对治疗股骨头坏死具有良好作用,并有以木豆叶为主药开发的中药新药“通络生骨胶囊”上市（袁浩,2004;袁捷,2005）。 植物内生真菌（Plant endophytic fungi） 是指生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌,使其寄生的宿主植物没有明显的病害症状。在长期的自然选择下,内生真菌与寄主植物形成和谐的共生关系,并能够产生结构类型多样的代谢产物（Noha, 2020）,具有抗菌、杀虫、抗病毒、抗肿瘤以及调节植物生长等多种生物活性（Gherbawy,2014）,其在农业、医药和食品等领域有着重要的应用前景。 目前有关木豆内生真菌的研究较少,根据内共生的理论,木豆内生真菌有可能产生与木豆组织相同功效的活性成分,如能从木豆中分离出能产生与宿主相同或相似的抗骨坏死生物活性成分的内生真菌,就可以利用特异菌株发酵方法获得目标化合物产物,这对减少木豆植物资源的过度消耗具有重要意义。 2、研究的目的和意义 本研究以木豆中分离筛选的内生真菌为研究对象,对前期分离的150余株内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物进行活性筛选,获得2株对成骨细胞增殖效果较好的菌株G6和Y3,本研究在前期工作基础上,采用形态鉴定和分子鉴定（ITS-rDNA序列比对分析）对获得的2株木豆特异内生真菌进行种属分类地位的鉴定,采用MTT法以促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖为活性筛选指标,对这2株内生真菌单独培养及共培养条件下的发酵性能进行考察,确定最佳发酵条件,并利用波谱分析技术鉴定木豆特异菌株G6和Y3促进成骨细胞增殖活性的关键代谢产物,本研究对于从木豆内生真菌中发掘对骨坏死具有防治作用的候选新药源具有重要研究意义。 3、主要论点与论据 3.1本研究以木豆中分离筛选的内生真菌为研究对象,对前期分离的150余株内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物进行活性筛选,获得2株对成骨细胞增殖效果较好的菌株G6和Y3,明确了其生物学特性,产孢特征,完成了菌株传代培养和菌种保存工作。 3.2根据产牡荆苷木豆特异内生真菌 G6 和 Y3 的菌落特征、菌丝与孢子形态等 特征与其 ITS-rDNA 序列的进化树分析,最终将 G6 鉴定为绳生二分枝毛壳 （Dichotomopilus funicola） 并得到 Genbank 登录号为 MF800960,将 Y3 鉴定为 腐皮镰刀菌（Fusarium solani） 并得到 Genbank 登录号为 MF800959。 成功鉴定 了G6 与 Y3,明确了其种属分离地位。 3.3 比较了内生菌 G6 和 Y3 单独发酵和混合发酵后代谢产物的差异,发现 G6 和Y3 单独发酵效果好于混合发酵。利用 UV、HPLC、HPLC-ESI-MS 等技术,鉴定了内生真菌 G6 与Y3 的发酵液产物中含有牡荆苷、球松素、染料木素、荭草苷等代谢产物。以牡荆苷含量为检测指标,对内生真菌 G6 和 Y3 的发酵培养条件分别进行了优化,获得了 G6 与 Y3 产牡荆苷的最佳发酵工艺条件。在最佳培养基条件下 Y3 与 G6 的牡荆苷产量分别为 79.49 mg/L与 18.72 mg/L 。 3.4 以小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 为体外成骨活性检测模型,通过利用 MTT 法研究内生真菌Dichotomopilus funicola Y3 与 Fusarium solani G6 乙酸乙酯提取物（浓度以牡荆苷含量计算）对成骨细胞 MC3T3-E1 促进增殖的活性,结果表明内生菌Dichotomopilus funicola Y3 与Fusarium solani G6 中的真菌牡荆苷均能显著促进成骨细胞增殖,为扩大抗骨坏死活性候选药物来源提供了新思路。 本研究首次鉴定了木豆特异内生真菌G6与Y3的种属分类地位,明确了活性菌株G6与Y3促进成骨细胞增殖活性的关键物质为牡荆苷,建立了G6和Y3菌株的最佳发酵工艺,本研究为从药用植物内生真菌中挖掘抗骨坏死活性的有效物质、扩大抗骨坏死活性候选药物来源提供了新思路。