[01216923]猪源益生芽孢杆菌筛选及其益生菌粉的制备与应用

本研究通过从仔猪粪便中分离筛选对其的常见肠道致病菌致病菌有强烈拮抗作用以及耐受胃和十二指肠极端环境的优良芽孢杆菌菌株,在体外研究其益生特性,建立完善液体发酵生产工艺,并通过动物养殖试验验证了其防病促长效果,为仔猪专业益生芽孢杆菌产品的开发和推广应用打下基础;同时对减少养猪环节中抗生素的使用,降低抗生素危害与风险,消除抗生素残留对人体健康的影响等也具有十分重要的意义。河南科技大学古绍彬副教授开展的“猪源益生芽孢杆菌筛选及其益生菌粉的制备与应用”的研究,获得了具有广谱拮抗作用、益生性能突出且安全的猪源益生芽孢杆菌BC158和BC361,并优化获得了其培养和菌粉制备工艺。取得的主要研究成果如下： （1） 从健康仔猪（15-40日龄）粪便中分离到46株芽孢杆菌,通过对肠道常见病原菌拮抗性研究,筛选到2株拮抗谱广的益生芽孢杆菌Bacillus spp. BC158 和BC361,这两株菌对大肠杆菌O8（E.coli O8）、肠炎沙门氏菌（S. enterica subsp. enterica serovar enteritidis ATCC 13076）、多杀巴氏杆菌（P. multocida ATCC 12947）等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC29213）、猪链球菌（S. suis ATCC 43765）、单增李斯特菌（L. monocytogenes ATCC 7644）等革兰氏阳性菌表现出较好的拮抗作用。生理生化实验和16S rDNA序列分析结果表明,1株菌为蜡样芽孢杆菌 BC158,也称 Bacillus cereus BC158,菌种保藏号为CGMCC 7433;另一株为凝结芽孢杆菌 BC361,命名为Bacillus coagulans BC361,菌种保藏号为CGMCC 9951。 （2） 对筛选到的BC158、BC361益生性进行了研究。肠粘液的粘附率研究结果表明BC158、BC361均具有较好的粘附率,其中BC158对前肠、中肠、后肠粘液的的粘附率分别为39.68%、33.49%和33.25%;BC361对空肠、回肠、结肠的粘附率分别为44.5%、48.9%和42.6%。酸和胆盐耐受试验发现BC15能够耐受pH 1和0.9%的胆盐环境,BC361能够耐受pH 2和0.9%的胆盐环境。在所测试的畜牧养殖常用抗生素中,两菌均有不同程度的敏感。此外,两菌均能产生淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等胞外水解酶,有助于饲养动物对饲料中淀粉和纤维素等营养物质的消化和吸收。 （3） 对芽孢杆菌BC158、BC361的安全性研究表明,两菌肠毒素（BCET）的检测结果为阴性,兔回肠结扎试验为阴性。小鼠饲喂试验发现,饲喂BC158、BC361三到四周期间试验组小鼠生长良好,无腹泻呕吐情况出现,且对小鼠的生长性能有较大的影响,日增重明显提高;小鼠解剖未见消化道病变,试验组小鼠的免疫指数较对照组明显提高,表明两株益生菌均能刺激小鼠免疫脏器的发育,提高小鼠的免疫力。 （4） 对BC158高密度发酵工艺进行了研究。结果表明,最佳发酵条件为：温度37℃,pH7.2,摇床转速180r/min,培养时间为18h。通过单因素试验和响应面优化实验,该菌的最佳发酵培养基的组成为：糊精12.40 g/L,玉米浆35.77 g/L,NaCl2.03 g/L。在此条件下,在此条件下该菌的活菌数为5.21×1010cfu/mL,在此基础上进一步优化获得了四级扩大培养工艺,通风搅拌深层液体发酵技术实现芽孢杆菌的高密度培养,活菌数为7.5-11.5×1010cfu/mL。。 （5） 对BC158菌粉制备工艺进行了优化。在所得的BC158发酵液中添加玉米淀粉,添加量为发酵液质量的8-15％,搅拌均匀后将所得混合物采用三效降膜蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩,一效蒸发温度为 85℃,二效蒸发温度为 75℃,三效蒸发温度为 65℃,当料液浓缩比达到 1:3 时停止浓缩。然后将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥,料流量恒定170 L/h,压力2 Mpa,喷雾干燥塔热风进口温度180℃,出口温度 80℃,喷雾干燥时间为 25s,即得到芽孢杆菌益生菌粉。水分的质量百分比为 5%,菌粉颗粒直径约为 0.06mm,活菌含量为 3×109-5×1010 CFU/g。 （6） 将制备的芽孢杆菌在仔猪和鸡养殖的饲料添加剂中进行添加使用,发现与对照组相比,可明显提高仔猪生长速度,减少仔猪腹泻率,对雏鸡成活率、出栏平均体重、料肉比有显著影响,其中成活率极显著高于对照组。