[01246175]帕金森病临床前期老年猴模型的建立与生物学标记物的评估机制

1、课题来源与背景：本课题来源广西自然科学基金（2013GXNSFDA019018）资助。

2、研究目的与意义：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）由于起病隐匿，并以严重的致残性、持续进展性、无法逆转性以及现阶段治疗上的无法根治性为显著特征，当前聚焦于疾病形成初始阶段的研究已成为该领域的热点之一。

由于目前几乎没有可能对处于临床前期的患者做出诊断，导致直接开展人类PD临床前期风险预警机制的研究无法进行。因此，选择与人类生理最为相近的灵长类动物开展PD临床前期动物模型的建立以及风险评估机制的基础研究、构建新的指标体系对PD临床前期进行病理发展评价、分级分类评估，对于解决这一难题意义重大。

主要论点：

1) 筛选并优化实验方案，以MPTP静脉小剂量给药、慢性诱导的造模方式，建立了模拟人类PD发病历程的PD临床前期老年猴模型。

2) 对PD老年猴模型以影像学手段跟踪评估PD猴模型各时期神经元缺失或功能障碍的程度，并对造模过程的变化规律与相互关系进行了探索，证实PET-CT影像在PD病人无临床症状出现以前即可以检查发现病灶并确诊疾病的发生。

3) 研究探讨了α-突触核蛋白和硝基化a-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴结肠中的表达，证实了自然老化对α-syn的氧化应激修饰有正向关系，可增加具有毒性的N-α-syn聚合物的表达。

4) 研究探讨了帕金森病猴模型中肝功能肾上腺的改变，实验结果推测小鼠PD模型的建立可能与肝及肾上腺的损伤以及炎症因子有关。

5) 初步合成针对PD外周血中α-突触核蛋白进行萃取富集的磁性纳米新材料，为建立高灵敏度检测方法奠定基础。

论据：

1)以MPTP慢性诱导的造模方式建立PD 临床前期老年猴模型：选用10-15岁左右的中老年食蟹猴为实验对象，通过后肢小隐静脉每天连续小剂量（0.2mg/kg）注射MPTP溶液（0.1mg/ml），持续10-15天时间，每天给予动物临床评分，持续观察症状进展3个月时间，每周至少进行一次临床评分，直至动物僵直、运动性震颤、步态、运动功能等各项临床指标达到稳定，则判定动物模型建立成功。

2)以影像学手段跟踪评估PD猴模型各时期神经元缺失或功能障碍的程度：分别在造模前、造模后30天，造模后90天采用正电子发射型计算机断层显像（PET-CT）影像方式对动物黑质-纹状体系统的多巴胺功能神经元的丢失情况进行评估（见图1）。所选用的是18F配体AV133，该配体可以特异性与囊泡单胺转运体（vesicular monoamine transporter，VMAT）结合;通过选取纹状体等感兴趣区可以直接读取数值，通过PET-CT影像检查，不仅可以直观看到多巴胺神经元的丢失，并且可以量化评估。

结果显示：通过PET-CT影像发现，动物在造模结束后，造模后第90天的影像检测结果比造模后第30天的多巴胺神经元丢失更多，说明动物即便是在停止给予药物，动物的症状依旧在进展，与人类的PD退行性相符。

通过PET-CT影像，可以发现部分动物在临床表面并不明显时，但是影像显示其多巴胺神经元已经丢失在50%以上，即验证了动物在临床前期在没有丢失大部分神经元的情况下，难以看到临床表现，但是体内其实已经受到神经毒素不同程度的损毁。

PET-CT影像在PD猴模型无临床症状出现以前即可以检查发现病灶并确诊疾病的发生，推测人类亦有相同现象。

a-突触核蛋白和硝基化a-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴结肠中的表达：健康食蟹猴（4～16岁）9只，其中青年猴3只（4岁），中年猴3只（10～11岁），老年猴3只（15～16岁）。免疫组织化学检测结果显示，在不同年龄段猴结肠中均有a-syn 阳性表达。

a-Syn 免疫活性物质成颗粒状分布于肌间神经丛，主要集中在肌间神经节胞质，也有少量颗粒状的阳性结构散在分布于存在a-syn 的神经纤维，老年猴结肠免疫阳性颗粒最多，青年猴结肠的免疫阳性颗粒最少;在不同年龄段猴结肠中均有N-syn 阳性表达N-syn 免疫活性物质成颗粒状分布于肌间神经丛，主要集中在肌间神经节的胞质，也有少量颗粒状的阳性结构散在分布于存在N-nsyn的神经纤维，老年猴结肠的表达量最高，青年猴结肠的表达量最低;a-Syn 和N-syn 在不同年龄段猴结肠中存在共定位。

4)帕金森病猴模型中肝功能、肾上腺损伤。

5)磁性萃取材料的合成与应用：以独创的基于共沉淀原理的“一锅法”合成包含稀土元素钇的磁性纳米复合材料Fe3O4@GO@Y，初步的谱学表征结果证实合成路线的可行性。该材料有望应用于萃取富集帕金森病病理性磷酸化突触核蛋白（pα-Syn），为后继建立检测pα-Syn的高灵敏度新方法打下基础。

创见与创新： 本项目对PD临床前期老年猴模型的建立以及多方面的相关研究，其成果为后继人适用PD临床前期BM风险指标体系的构建、最终实现PD早期诊断、早期干预打下良好的理论与实践基础，这无疑具有重要的学术价值及现实意义，并将在不久的将来产生良好的社会效益和经济效益。

存在的问题：选择食蟹猴作为实验模型是研究帕金森病的良好模型，但其购置价格及饲养费用昂贵，因此本研究希望得到后续支持，进一步深入研究。

历年获奖情况：获得广西科技进步奖三等奖1项。