[01260909]基因编辑克隆猪的研制及其在医学研究中的应用

由于在基因组、解剖结构、生理代谢和器官大小等方面与人类较为接近，猪已成为人类疾病研究的重要模式动物和潜在的异种器官移植供体。

近十年来，本项目组建立了具有国际领先水平的、稳定高效的猪基因编辑平台和克隆猪培育平台，通过敲除猪体内引起猪-人异种移植免疫排斥的抗原基因，同时转入抑制免疫排斥反应的人源化基因，培育了用于异种组织器官移植供体、疾病模型研究和新一代生物材料研究和产业化的基因修饰克隆猪;分别构建了猪B细胞，肺，肾脏发育缺陷的基因修饰克隆猪，用于开展在猪体内再生人源化器官的研究。

取得如下标志性的研究结果及成果：（1）建立了具有国际领先水平的、稳定高效的猪基因编辑平台和克隆猪培育平台利用CRISPR/Cas9敲除单个基因时，双等位基因同时敲除的比率达到40%–70%，两个基因同时双等位基因敲除的比率高达50%，且均未发现脱靶现象。

以巴马小型猪细胞为细胞核供体，以长白约克夏二元杂交猪为受体时，获得60%受胎率和窝仔数10头的转基因克隆猪移植结果。基因编辑效率和克隆效率均达到国际领先水平。

在国际上首次培育了中国特有品系的用于异种器官来源、生物材料来源的低免疫原性的基因修饰猪。利用中国特有的近交系五指山小型猪、巴马小型猪和大长白猪，在GGTA1基因敲除的基础上，分别转入CD46和CD46/TM/CIITA-DN基因。在GGTA1/β4GalNT2两基因敲除的基础上，分别定点敲入hCD46/hCD55/hTBM、hCD46/hCD55/hEPCR和hCD46/hCD55/hLEA29YINS基因。培育了可用作异种心脏、肾脏和胰岛移植潜在供体的克隆猪。同时敲除长白猪的三个主要的异种抗原基因，培育GGTA1/β4GalNT2/CMAH三基因敲除猪。可作为心脏瓣膜移植和红细胞输血的新的材料来源，也可作为医学填料及美容化妆产品的原料来源。

成功培育了五种重大疾病的基因修饰猪动物模型。培育了免疫系统缺陷（C3-/-）、动脉粥样硬化（ApoE-/-，ApoE-/-/LDLR-/-）、结节硬化症及肿瘤（TSC1+/-）、5-羟色胺缺乏（Tph2-/-）和糖尿病（GIPR-DN）模型猪。

成功构建了三种用于体内再生人源化组织和器官研究的发育缺陷猪模型培育了B淋巴细胞缺失（IgM-/-）、肺脏缺失（TTF1-/-）和肾脏发育缺陷猪模型（Six1-/-; Six1-/-/Six4-/-），为通过人干细胞-猪囊胚互补在猪体内再生人B淋巴细胞、人肺脏和肾脏奠定了基础。

鉴定异种移植中引起微血管慢性排斥的新抗原基因利用GGTA1/CMAH双基因敲除猪和GGTA1基因敲除猪分离的原代肾微血管内皮细胞和主动脉内皮细胞对食蟹猴进行免疫，并对这两类细胞进行高通量转录组测序，通过对差异表达的基因分析及验证，发现了32个潜在的引起微血管慢性排斥反应异种抗原基因，为通过进一步的基因修饰来降低异种移植中的微血管免疫排斥反应打下基础。

主要经济技术指标、应用推广及效益发表研究论文50余篇，其中5篇代表文章他引33次。获得发明专利1项。获得国家重点研发计划1项和国家自然科学基金3项。该项目研究极大地推动了基因编辑克隆猪在医学研究领域的应用，具有广阔的转化前景，必将产生巨大的经济效益和社会效益。截止到目前，南京医科大学三基因敲除猪技术已经实现了总计105.3万元人民币的专利技术转让。

其中创观（苏州）生物科技有限公司利用本项目转让的专利技术，已经获得园区政府2000万元的投资，并建立了1874平方米的GMP生产车间，于2019年9月投入试生产。