[01267737]特异性抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体的制备、鉴定及应用

【摘要】本发明涉及到两种抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列，本发明还涉及生产这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201371和CCTCC NO：C201373，本发明还涉及单克隆抗体的制备方法及应用，本发明中EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7单克隆抗体可以用于流式和免疫荧光检测白血病患者外周血和肿瘤标本中EpCAM蛋白的表达，还可以介导ADCC体外杀伤肿瘤细胞和体内肿瘤的治疗。

本发明的又一个目的是提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。由这两株杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体在本文中分别简称为AE4单克隆抗体和AE7单克隆抗体。

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在流式细胞术检测白血病患者外周血内EpCAM表达实验中的应用。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在细胞免疫荧光检测肿瘤细胞的EpCAM表达实验中的应用。

本发明的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在体外能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞并且能够抑制体内肿瘤的生长有益效果。

本发明提供了两株抗人EpCAM的单克隆抗体、其制备方法、鉴定及应用，其特异性好，灵敏度高。能够应用于检测人外周血和肿瘤组织中EpCAM的表达，作为癌症转移诊断和预后评估指标之一。

另外，本发明的单克隆抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞以及抑制体内肿瘤的生长，因此，此发明对癌症的诊断及治疗具有重大的临床意义。

具体说来，本发明的一个方面涉及两种EpCAM特异性的单克隆抗体及其制备方法， 这两种单克隆抗体在本发明中分别称为AE4和AE7，它们的类型分别为IgG2b， κ和IgG2a， κ，它们均针对EpCAM第24-265位氨基酸序列。

本发明的另外一个方面涉及稳定分泌EpCAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。

这两株杂交瘤细胞株已经于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072），保藏编号分别为CCTCC NO: C201371和CCTCC NO: C201373。

本发明的另外一个方面涉及制备所述单克隆抗体的方法。制备方法包括重组蛋白EpCAM的表达与纯化，用纯化后蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，筛选出能够稳定分泌对重组EpCAM有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清中或者从小鼠腹水中获取单克隆抗体。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在流式检测肿瘤细胞系和癌症患者血液标本中的EpCAM表达的应用。用本发明的AE4或AE7单克隆抗体通过流式技术检测肿瘤细胞系和癌症患者外周血中的EpCAM蛋白的表达，结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在流式水平用于检测肿瘤细胞和癌症患者外周血中的EpCAM表达。

本发明的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在免疫荧光检测肿瘤细胞及肿瘤组织内EpCAM表达中的应用。

用本发明的AE4或AE7单克隆抗体通过免疫荧光实验鉴定肿瘤细胞系和肿瘤组织上EpCAM蛋白的表达。

结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在免疫荧光水平用于检测肿瘤细胞系和肿瘤组织中的EpCAM表达。