[01322484]蔬菜农药残留量速检技术研究

1、任务来源：“蔬菜农药残留量速检技术研究”为2004年唐山市科技局下达的研究计划项目，项目编号为04124901A。2、应用领域和技术原理：该项目研究成果为采用生物传感器法快速测定蔬菜中的农药残留量技术，主要应用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留量的快速检测。生物传感器法是近年来农药残留速测技术中的研究热点之一。生物传感器是常由一种生物敏感部件（如胆碱酯酶）与转换器紧密配合，对特定种类化学物质具有选择性和可逆响应的分析装置。生物敏感部件与特定分析物之间反应会产生一些物理化学信号的变化，再通过转移器转化、放大后显示或记录下来。生物传感器的优点是微型化、响应速度快、灵敏度高、样品量极少。但是现阶段胆碱酯酶等生物材料在固定化过程中活性容易失活问题还没有很好解决，影响了这一技术的推广应用。为获得准确的测定结果，急需研制出活力均一、性能稳定的固定化酶,因此固定化乙酰胆碱酯酶的制备技术、以固定化乙酰胆碱酯酶制备生物传感器和蔬菜农药残留的快速检测方法成为急需研究的课题。该项目研究成功了生物传感器法快速测定蔬菜中农药残留量技术，主要的研究成果为：⑴从家蝇头部提取乙酰胆碱酯酶，用亲和层析法纯化后最高比活力为280μmol·min-1·mg-1，回收率为21.26%，该纯化方法得到的酶纯度较高。⑵研究成功的固定化乙酰胆碱酯酶酶膜的批量制备技术，具有操作简便、获得的酶膜活力重现性好、性能稳定，为实现固定化乙酰胆碱酯酶膜的商品化创造了条件。⑶开发成了低温冰浴操作技术，采用低温冰浴操作技术制备固定化酶膜，酶的活力损失小，节省酶，成本低。⑷研究成功的固定化酶膜保存方法，延长了酶膜的保存寿命。研究的酶膜失活后的复能技术，增加了酶膜的使用次数。⑸首创的乙酰胆碱酯酶活力测定方法--电化学计时电位法，简便、快速、准确、可靠，适用于各种形态乙酰胆碱酯酶的活力测定。⑹研制的胆碱酯酶生物传感器用于测定有机磷农药残留精密度高，检出限低。研制的恒温电解池，可方便地实现各种恒温操作，使测定结果更加准确。⑺研制的有机磷农药检测仪器能够快速、准确检测出蔬菜、水果中的农药残留，并且操作简便，使酶抑制反应在最佳状态下进行，适于批量检测蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。3、主要技术性能指标：该项目系统地研究了乙酰胆碱酯酶活力测定方法、高敏感度乙酰胆碱酯酶的制备技术、固定方法、复能技术及有机磷农药的比对检测技术等，达到了课题任务合同的要求。该项目的主要技术性能指标为：⑴固定化酶膜的活力重现性RSD≤5%，（任务合同书未要求）；⑵固定化酶膜保存时间≥60d（任务合同书要求15 d）；⑶固定化酶膜的复能次数5-6次，平均复能率为93.6%（任务合同书未要求）；⑷农药残留的检出限1×10-10～10-9mol/L；检测时间30min（蔬菜样品处理20 min，直接测量10 min），任务合同书要求检出限为1×10-6mol/L、测量时间为10min；⑸酶复活时间20min（任务合同书要求10min－30min）。4、与国内同类技术比较通过国内查新，检索到有关蔬菜农药残留检测的文献多篇，但该课题采用酶生物传感器法定量测定蔬菜中有机磷农药残留量，即以硝酸纤维素膜片为载体，在低温冰浴条件下，通过交联法固定乙酰胆碱酯酶，利用BR缓冲溶液提取有机磷农药，采用恒电流计时电位法测定乙酰胆碱酯酶的活力，未见相同报道。河北省分析测试研究中心对该课题组制备的不同批次的固定化乙酰胆碱酯酶膜进行了检测，检测结果表明，不同批次制备的固定化乙酰胆碱酯酶膜的总体活力平均值为：3.63mV·s-1，相对标准偏差为：2.99%；固定化乙酰胆碱酯酶膜可连续使用5-6次，平均复能率为：93.6%；固定化乙酰胆碱酯酶膜贮存60d后平均残余活力为：83.6%。河北省分析测试中心利用该课题研究的蔬菜农药残留检测方法--生物传感器法，与气相色谱法（农业行业标准NY/T761.1-2004）、分光光度法（国家标准GB/T5009.199-2003）进行了对比。结果表明，与气相色谱法相比，生物传感器法检测时间短，仅需要0.5小时（含样品处理时间）、样品采用BR缓冲溶液处理容易、仪器操作简单，蔬菜中对硫磷、辛硫磷、氧化乐果、敌敌畏的检出限分别为2.39×10-10mol/L、3.65×10-9mol/L、7.36×10-10mol/L、2.87×10-10mol/L，经单位还算后每kg蔬菜中的蔬菜中对硫磷（分子量291.27）、辛硫磷（分子量298.3）、氧化乐果（分子量213.2）、敌敌畏（分子量220.98）的检出限分别为1.68×10-3mg/kg、2.79×10-2mg/kg、3.92×10-3mg/kg、1.59×10-3mg/kg，并且检测结果与气相色谱法的检测结果基本一致。与分光光度法相比，分光光度法对含叶绿素较高的蔬菜的农药残留检测易受到色素的干扰，而生物传感器法的测定不受色素干扰；对测定的部分农药的检出限也提高了10－500倍（国家标准GB/T5009.199-2003给出的分光光度法的检出限为对硫磷、辛硫磷、氧化乐果、敌敌畏的检出限分别为1.0mg/kg、0.3mg/kg、0.8mg/kg、0.1mg/kg）。农药最高残留限量（MRLs）的国家标准中规定蔬菜水果中敌敌畏 ≤0.2mg/kg、辛硫磷 ≤0.05mg/kg、毒死蜱 ≤1.0mg/kg、对硫磷和氧化乐果不得检出。该课题研究的生物传感器法的检出限为敌敌畏0.00159mg/kg、辛硫磷0.0279mg/kg、毒死蜱（分子量为350.5）0.02 mg/kg。结果表明能满足蔬菜农药残留检测的要求。5、成果的创造性、先进性该项目立题准确，技术方案合理，系统地研究了乙酰胆碱酯酶活力测定方法、固定方法、复能技术及有机磷农药的比对检测技术等。该项目提出的乙酰胆碱酯酶活力测定方法适用于各种形态乙酰胆碱酯酶的活力测定；开发的传感器性能稳定；制备的固定化酶膜活力均一、可重复使用；采用BR缓冲溶液提取蔬菜中的有机磷农药，背景干扰小，提取率高，消除了基体成分的干扰，检出限低，精密度高；开发的有机磷农药测定方法，具有简便、快速、准确的特点。该项目在以下方面具有创新：⑴在国内首次提出了新的乙酰胆碱酯酶活力测定方法--恒电流计时电位法。研究成功的乙酰胆碱酯酶活力测定方法--恒电流计时电位法，具有快速、准确、可靠的特点，适用于各种形态乙酰胆碱酯酶的活力测定，明显优于常规测定方法。确定电化学计时电位法测定乙酰胆碱酯酶活力的最适测定条件为：测定温度为26 ℃，pH7.4，底物浓度2.0mmol/L，电解电流为0.020mA。⑵成功开发出乙酰胆碱酯酶的硝酸纤维素膜固定化技术。研究得到了乙酰胆碱酯酶的固定化方法最佳操作条件；乙酰胆碱酯酶的固定化采用低温冰浴操作，酶活力损失小，保障了固定化酶膜的活力均一。确定孔径0.45μm的硝酸纤维素膜为较优固定化载体， AchE最佳用量为5mL，戊二醛用量为2μL时，固定化酶的活力最高。同时确定固定化操作过程始终在冰浴中进行，最佳固定化时间确定为8h。⑶成功开发出酶膜失活后的复能新技术，增加了酶膜的使用次数，使固定化乙酰胆碱酯酶膜可重复使用5－6次。⑷成功开发出蔬菜农药残留速测方法。采用BR缓冲溶液提取蔬菜中的有机磷农药，背景干扰小，提取率高，标准加入法测定农药残留，消除了基体成分的干扰，检出限低，精密度高。农药残留的检出限为1×10-10～10-9mol/L；检测时间30min。6、经济、社会效益分析为适应农药残留快速检测技术便捷、准确、智能化的发展要求，该课题研制的农药残留快速检测仪器，具有灵敏度高，检出限低等优点，适合开展蔬菜农药残留量检测技术应用，对控制食品中的有害物质，发展无公害食品等会产生积极的作用。该课题的研究成果为建立健全农产品质检体系，开展农产品质量安全监管，实施农产品市场准入监管和跟踪溯源管理，提供了技术支持。通过对农产品生产基地实地检测和市场抽查，可以将高残留农产品杜绝在市场之外，防止中毒事故发生，保障人民健康，所以该课题研究的蔬菜农药残留速检技术为当前生产、销售、监管部门及人民群众所急需，具有十分广阔的应用前景。该课题的研究成果如能产业化，将会取得很好的经济效益。每台仪器生产成本为 3.5万元，预计市场可接受的价格为4.6万元，故每台仪器的利润： 4.6－3.5＝1.1万元。如年产仪器300台，可获利润： 1.1 ×300＝330万元。 推 广 应 用 前 景 与 措 施该项目从敏感度较高的家蝇头部提取纯化乙酰胆碱酯酶，研究了乙酰胆碱酯酶的固定化技术，能够批量制备活力均一、性能稳定的固定化酶膜，为实现固定化乙酰胆碱酯酶膜的商品化创造了条件。采用本技术制备的固定化酶膜，可以用在酶抑制法中作标准酶试剂，克服了现行酶抑制法存在的缺陷，使该法更加规范，测定结果更加准确，灵敏度更高。利用制备的固定化酶膜，制作的胆碱酯酶生物传感器，具有灵敏度高，检出限低等优点。开发的蔬菜农药残留量检测仪器适用于市售蔬菜农药残留量的现场快速检测，具有非常好的推广应用前景。唐山市农业局蔬菜办公室、丰南区农业服务中心蔬菜站、丰润区农业畜牧水产局蔬菜站分别利用该课题研制的蔬菜农药残留检测仪器对本地市售蔬菜进行了检测，使用表明该课题研制的蔬菜农药残留检测技术能满足实际工作的需要，检测方法规范、测定结果准确、灵敏度高、适合现场分析等优点,在从大批量蔬菜中筛选检测农药污染的蔬菜有着良好的应用前景。该项目研究成果为贯彻落实《国务院关于进一步加强食品安全工作的决定》，建立健全农产品质检体系，全面开展农产品质量安全例行监测的要求，为开展农产品质量安全监管、实施农产品市场准入监管和跟踪溯源管理，提供了技术支持。通过对农产品生产基地实地检测和市场抽查，可以将高残留农产品杜绝在市场之外，防止中毒事故发生，保障人民健康。对控制食品中的有害物质，发展无公害食品，增加农民收入等也有积极的作用。所以该课题研究的蔬菜农药残留速检技术为当前蔬菜生产、销售、监管部门及人民群众所急需，具有十分广阔的应用前景，会产生良好的社会效益和经济效益。为使固定化乙酰胆碱酯酶膜的保存寿命进一步提高，固定化酶的活力稳定技术有待进行深入探讨。残留检测仪器未制作成一体化，下一步需联合电子、计算机、机械设计专业等有关人员进行研究，使仪器一体化、小型化。