[01351975]以MEK和AKT为靶点的双通路抗肺癌先导化合物的发现

本项目采用fragment-based drug design （FBDD） 设计策略,利用PD0325901 （MEK抑制剂）和BX517（PDK1抑制剂）作为先导化合物,设计和合成了一系列新型MEK/Akt双重抑制剂。按照计划合成和建立了一个分为3个系列的包含43个新化合物的化合物库。系列Ⅲ中的新化合物9za显示出最强的抗肺癌活性。因此,我们后期针对化合物9za展开深入的分子机制研究。 1、设计合成：建立了一套设计、合成MEK/AKT双通道抑制剂的设计与合成方法。利用计算机辅助设计平台,采用前述Scheme 1的合成路线,共合成了三个系列共43个化合物,并对其进行了结构确证。 2、活性初筛：对所得到的目标化合物通过肺癌细胞（A549 或NCI-H460）生长抑制试验了初步的活性筛选,结果发现多数化合物对肺癌细胞有良好的生长抑制作用,其中化合物9za活性最好。 3、靶点评价：采用蛋白免疫印迹实验,考察了化合物9za对A549细胞株RAF-MEK-ERK通路和PI3K-PDK1-AKT通路的磷酸化抑制活性。结果显示,化合物9za可以下调RAF-MEK-ERK 通路中ERK 的磷酸化同时也可以下调PI3K-PDK1-AKT 通路中的AKT的磷酸化,从而产生对癌症细胞的生长抑制作用。 4、建立一套具有指导价值的双通路抑制剂的评价模型、参数和方法 ⑴建立基于MEK激酶和PDK激酶的计算机虚拟筛选平台 借助MOE软件平台,分别利用现有的PD0325901-MEK1以及 BX517-PDK1复合物晶体模型,寻找到两个激酶的关键结合位点,将所设计的化合物分别与这两个虚拟模型进行对接,发现双通路抑制剂的共同结构特征,并进一步指导化合物的设计和合成。 ⑵通过已经建立的多种肿瘤细胞抑制活性的检测方法,对设计和合成的双通路抑制剂进行活性初筛 利用现有的多种肿瘤模型细胞,包括大细胞肺癌细胞NCI-H460、肺腺癌细胞A549和H1299等非小细胞肺癌细胞（NSCLC）考察设计、合成的化合物对它们的生长抑制作用,结合前期的计算机模拟结果,对化合物活性进行初步筛选、评价,得到了目标化合物。 ⑶ 通过进一步的分子生物学评价,验证双通路抑制剂的抗肿瘤机制 将RAF-MEK-ERK以及PI3K-PDK1-AKT通路中的关键下游底物设置为考察指标,利用蛋白免疫印迹实验（Western blotting）,并以经典的单通路抑制剂AZD6244 和 MK2206为阳性对照,考察所获得的双通路抑制剂对MEK和PDK1激酶的抑制作用。 5、机制研究 分子机制研究结果表明,9za对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞具有细胞毒和凋亡诱导作用并会引起细胞周期阻滞,9za通过PDK1/Akt/mTOR分子信号通路诱导自噬的产生,PDK1是其作用靶蛋白。另外,9za介导的自噬与其具有的细胞毒和凋亡诱导作用紧密有关,抑制9za诱导的自噬可显著增强9za介导的细胞毒和诱导凋亡作用。最后我们还发现9za是通过MEK/Akt双通路引起NSCLC细胞的线粒体途径凋亡。 到目前为止,本项目利用计算机辅助设计平台,采用前述Scheme 1的合成路线,共合成了三个系列共43个化合物,建立了包括43个新化合物的化合物库且对其进行了结构确证,并筛选出了2个具有强大抗肿瘤活性的新化合物9za和9d。本项目建立了一套具有指导价值的双通路抑制剂的评价模型、参数和方法：即建立基于MEK激酶和PDK激酶的计算机虚拟筛选平台,通过已经建立的多种肿瘤细胞抑制活性的检测方法,对设计和合成的双通路抑制剂进行活性初筛,并将RAF-MEK-ERK以及PI3K-PDK1-AKT通路中的关键下游底物设置为考察指标,利用蛋白免疫印迹实验（Western blotting）,以经典的单通路抑制剂AZD6244 和 MK2206为阳性对照,考察所获得的双通路抑制剂对MEK和PDK1激酶的抑制作用。另外,本项目深入进行了新化合物9za抗肿瘤的分子机制研究。目前,本项目已发表SCI论文2篇,另投稿SCI论文1篇。