[01359670]猪肝细胞生物人工肝应用中猪内源性逆转录病毒传播研究

一、生物人工肝(BAL)构建：1、新型BAL的构建：本研究构建的BAL设计了一细胞环路并持续注入氧气，培养的肝细胞可得到较充分的营养物质和氧气，有利于肝细胞发挥作用，同时方便更换培养液、检测肝细胞活率。结果是循环6h内肝细胞活率能保持较高水平，肝细胞悬液ALT与循环前无显著差异。表明本系统能基本满足肝细胞培养的要求。2、新型BAL的体外功能评价：本研究所构建的BAL中培养肝细胞不仅能产生白蛋白，而且大部分可进入中空纤维管内腔循环液中，达到了BAL治疗的基本要求。该BAL基本具备肝细胞色素P450系统的生物转化功能。该新型BAL具有一定的肝功能支持作用，且具有一定的稳定性，可望用于肝衰竭的治疗和为过渡到肝移植创造条件。该研究为国际先进水平，对进一步开展ALF治疗研究具有重要的意义。　　二、动物ALF模型的制备：一期门腔端-侧分流、胆总管结扎切断术制作犬ALF模型成功，该模型方法可靠，稳定性、重复性好，有较宽的治疗窗，较符合ALF的病理生理变化，它可被视为较理想的大动物ALF模型用于BAL的研究。　　三、新型BAL体外灌流前后PERV的传播研究：依据高度保守的PERV gag基因序列，选用特异性引物，建立了猪肝细胞PERV原病毒DNA检测的PCR方法和血清、肝细胞培养上清液PERV RNA检测的RT-PCR方法。本研究方法和成果在国际处于先进水平，对BAL的生物病原体检测和进一步应用具有重要的意义。1．猪肝细胞培养上清PERV的检测：研究认为中国实验用小型猪肝细胞携带PERV；PERV可释放到血清中；猪肝细胞培养24h后该病毒颗粒已释放到培养液中；PCR和RT-PCR方法检测PERV具有特异性强、简便的特点。2．新型BAL体外灌流前后PERV的检测：猪肝细胞用于新型BAL体外灌流6h未检测到PERV传播，较为安全。　　四、新型BAL治疗ALF动物后PERV的传播研究：结果灌流前后肝细胞循环液和犬血清PERV RNA均为阴性，提示猪肝细胞携带的PERV可能尚未释放或病毒浓度较低且不能通过BAL的中空纤维管，较灵敏的RT-PCR方法也未能检测出来。　　结论认为，使用猪肝细胞的新型BAL治疗ALF犬6h后未发现PERV传播。本课题研究结果为临床安全应用BAL系统治疗ALF提供了理论依据，研究成果达到了国际先进水平。治疗前后分别取肝细胞循环液和犬血清，用RT-PCR检测PERV。结果表明使用猪肝细胞的新型BAL治疗ALF犬6h后未发现PERV传播，较为安全。　　本技术的完成为猪肝细胞用于BAL的安全性提供了证据。本项研究成果的推广将为猪肝细胞BAL的安全应用提供保障，为肝衰竭病人渡过急性期，争取肝再生或者肝移植而恢复，应用前景十分广阔。本研究成果通过以下措施进行推广：　　1．利用学术期刊加以推广应用，本研究成果在国内外期刊发表相关论文11篇，其中3篇被SCI收录，并被SCI引用3篇次，推进了国际BAL领域的研究和应用；另外8篇发表在中国普通外科杂志等重要期刊上，引起广泛重视和认可。　　2．利用国际、国内学术会议机会进行推广。本研究成果在沪港肝胆外科会议、全国肝胆外科会议、全国器官移植会议等多次发言，促进了国内人工肝领域研究的发展。　　3．本课题使用PCR和RT-PCR检测猪肝细胞内源性逆转录病毒的方法已在南通市第一人民医院、南通市第三人民医院、南通市肿瘤医院得到应用，促进了该成果的推广。　　2008年获南通市科技进步二等奖。