[01399765]安全高效兔出血症病毒基因工程亚单位疫苗的创制与应用

我国是兔养殖、消费及出口大国。兔养殖量约占世界的60%。兔出血症（俗称兔瘟）是由兔出血症病毒（RHDV）引起的烈性兔传染病,死亡率高达90%以上。长期以来,国内外防控该病主要依赖组织灭活疫苗。该疫苗存在生物安全性差、规模化生产难、质控标准低、缺乏高效便捷配套检测方法等技术难题。在22项国家级及省部级等课题资助下,历经12年科技攻关,取得以下创新技术成果： 1. 创建高效表达RHDV主要结构蛋白的重组杆状病毒,攻克了疫苗抗原不能在细胞上繁殖的技术瓶颈。 首次揭示我国流行G2、G6基因型RHDV,且以G6型为主。从分离鉴定的28株RHDV中,筛选出具有超强毒力RHDV皖阜株（G6型）,验明其对所有基因型RHDV均可提供完全保护。经病毒蛋白功能鉴定,确立将RHDV皖阜株全长结构蛋白VP60作为疫苗候选抗原。评价不同表达系统对VP60表达效率及形成病毒样颗粒的能力,筛选出最优杆状病毒-昆虫细胞表达系统（BEVS）。解析VP60不同区域氨基酸构成对提高抗原性及病毒样颗粒形成的影响,在VP60-NTA区域插入VP60自身B细胞表位并对全长VP60基因进行优化,经多次单克隆纯化,获得安全性好、纯净性高、免疫原性强、适应细胞培养的重组杆状病毒“BAC-VP60”,为基因工程亚单位疫苗的创制和产业化提供了优质毒种。 2. 创制国际上首个兔出血症病毒基因工程亚单位疫苗,实现了疫苗的规模化生产和精准质量控制。 采用全悬浮、无血清、高密度培养的Sf9昆虫细胞制备病毒样颗粒作为抗原,优选毒种、抗原制备最佳方案,实现了抗原高效表达（HA效价达1:1024 以上,即100 μg/ml 以上）和500 L细胞发酵罐全悬浮培养。制订了疫苗制造与检验规程及质量标准,创制了兔出血症病毒基因工程疫苗,获得国家一类新兽药证书。与传统疫苗相比,抗体水平提高2倍以上,细胞免疫应答于免疫后第3天显著提升,能抵抗世界动物卫生组织（OIE）国际标准规定攻毒剂量1000倍强毒的攻击,疫苗保护率可达100%,免疫期延长1个月,保存期延长6个月,每年可挽救用于制备传统疫苗的家兔60万只以上。疫苗安全性和免疫效力等关键技术指标达国际领先水平。 3. 建立RHDV抗原抗体诊断及检测新技术,创建了兔出血症病毒基因工程疫苗应用配套技术体系。 基于自主研发的10株RHDV单克隆抗体,创制2种快速、准确、便捷（10分钟内,准确率99%,基层技术人员可在场内操作）的抗原抗体检测胶体金试纸条;建立6种高效、安全、精确（96个样/批次,以病毒样颗粒替代活病毒,单抗可特异性识别受体位点）的抗原抗体ELISA检测等技术。创建以疫苗免疫为核心,集免疫程序、动态监测和生物安全等为一体的兔出血症综合防控技术体系,解决了我国兔出血症临床一线诊断无产品,实验室检测效率低的难题。 本项目获授权发明专利3件;国家一类新兽药证书1个;农业转基因生物安全证书（生产应用）1件,制订行业和地方标准4项;出版书籍4本;发表论文45篇;发明专利实现技术转让费900万元。自2006年始,本项目所创制的防控技术推广应用遍及全国20多个省市,快速有效控制了兔出血症的流行和发生,增加兔养殖业产值22.52亿元,新增利润6.43亿元,具有显著的社会、经济和生态效益。