[01432072]益生芽孢杆菌、霉菌等在农用生物制品制造中的关键技术研究与应用

益生芽孢杆菌、霉菌等微生物可以制造选择性强、靶向性好、易降解、安全性高的绿色农用生物制品，涉及生物农药、微生态制剂、生物疫苗等，因此备受关注。全球生物来源的绿色农用制品有3 000多种，而中国仅400余种。绿色农用生物制品的多样性、复杂性要求生产方法多元化，增加了制造难度。益生芽孢杆菌、霉菌等微生物在绿色农用生物制品产业化过程中存在以下瓶颈问题：（1)自主知识产权高产菌株少，遗传稳定性差；（2)目标产物代谢途径复杂，生产过程副产物多，产品效价低，发酵周期长，实时在线监控难；（3)产品纯度及收率低，分离要求高，货架期短。为此，项目组在国家、省部级项目和企业合作项目支持下，经16年研究探索，取得重大突破，解决企业生产中的技术瓶颈，发明关键共性技术并实现产业化，效果良好。成功应用于蜡样、凝结等芽孢杆菌系列制品，多抗菌素、安来霉素等抗生素，赤霉酸GA<,4+7>、GA<,3>等抑菌促生剂,生物疫苗等十余种农用生物制品生产中，打破国外公司垄断，该技术还成功应用到生物医药、食品添加剂等领域。主要技术发明点如下：发明了荧光探针结合N<'+>诱变的高产菌株筛选方法，基于蛋白质组学和纳米抗体电化学分析优化代谢通路，强化系列目标产物代谢途径，发明了菌株恒化培养装置。成功筛选具有自主知识产权的原始菌株10株，并保藏于国家菌种保藏中心，诱变后筛选出35株优良菌株，可稳定传代9代以上，菌体活性提高30% 〜200%。发明了图像在线采集、多阶段发酵和电极高效催化等多个元件系统，实时监控芽孢杆菌、霉菌等发酵状态，实现高密度培养，提高产物转化速率。开发节能高效的新型生物反应器，并发明新型喷嘴系统，适用多个产品，提升产品效价，实现产业化。部分产品实现以非糖物质等为廉价原料的绿色合成技术。如多抗菌素效价达6 800mg/L，生产周期48 h内，能耗下降34%。发明了发酵与结晶分离过程集成技术，实现了膜分离、结晶工艺及产品成型技术，消除产物抑制，提高产品纯度。发明活菌保护剂，开发活菌制剂、泡腾片等新剂型，解决芽孢出芽率和活性低的问题。如赤霉酸GA<,4+7>纯度达99%，国际市场占有率70%以上；芽孢出芽率达90%,产品货架期达30〜36个月。通过上述共性关键技术开发与应用，在江苏丰源、中牧等近10家企业实现多项成果产业化，已获8项农药登记证、1项药品注册证和10个批准文号，形成具有国际竞争力的绿色农用生物制品产业链。共申请发明专利32项（PCT专利3项），授权25项，形成覆盖关键技术核心专利群，相关专利获国家、江苏省优秀专利奖；发表论文89篇，SCI收录69篇；专著6部、教材3本；近三年新增销售额8.6亿元，新增利税1.5亿元。建立江苏多肽类药物工程技术研究中心、江苏生物医药协同创新服务示范基地等合作平台。协同南京农业技术推广站建2.37万亩次示范区，化药使用量及每亩成本降低50%以上，取得了良好的经济效益和社会效益。