[01444027]蛋白酶基因的优化和表达及高效生物蛋白质饲料的研制和应用

随着我国饲料工业和养殖业的快速发展,蛋白质饲料资源日益短缺,当前我国每年蛋白质饲料资源的缺口约5000多万吨。如何利用微生物发酵和酶解来提高羽毛粉、棉粕、血粉等低质蛋白质饲料的营养价值,以及提高豆粕等优质蛋白质的附加值,对于有效地开发和利用蛋白质饲料资源、降低饲养成本具有重要意义。主要内容如下： 1、蛋白酶基因的优化及高效表达 （1）从自然界筛选到一株米曲霉和一株枯草芽孢杆菌,分别在固态和液态培养基中发酵72 h,其蛋白酶活力达到3256.61 U/g和690.03 U/mL。 （2）利用RT-PCR扩增得到米曲霉和枯草芽孢杆菌的中性和碱性蛋白酶基因4个,利用DNA改组技术获得了一个优良的突变基因,该基因第1022位的碱基T被突变为碱基C,从而使蛋白酶中的半胱氨酸变成了精氨酸。 （3）该蛋白酶突变基因与pGAPZαA质粒连接后转入到毕氏酵母中,液态培养48 h后其蛋白酶活力比原始基因所表达的蛋白酶活力提高了36.40%（P＜0.05）。 （4）改组基因所表达的蛋白酶在温度30-70℃及pH6.5-8.0范围内保持稳定,优于原始的蛋白酶。 2、酵母工程菌和米曲霉对羽毛粉等非常规蛋白质饲料的发酵效果 与原始羽毛粉相比,含改组蛋白酶基因的重组酵母发酵的羽毛粉,可使总氨基酸和赖氨酸含量及鸡的蛋白质代谢率分别提高28.78%、71.17%和15.20%（P＜0.05）。利用米曲霉发酵复合劣质蛋白质饲料（棉粕、羽毛粉、血粉）后,可使其中的粗蛋白质、钙、磷的代谢率显著提高（P＜0.05）。 3、酵母工程菌发酵羽毛粉替代鱼粉后对肉鸡生产性能影响 利用发酵羽毛粉可完全替代饲粮中鱼粉（3-5%）这种优质蛋白质资源,并使肉鸡日增重提高13.38%,蛋白质代谢率提高13.21%,经济效益提高13.51%。 4、豆粕等常规蛋白质饲料的酶解和微生物发酵及应用 利用3×3拉丁方设计,获得枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、异常汉逊酵母最佳配比（2:1:2）,再与蛋白酶组合来发酵和酶解豆粕,使豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量降低90%以上,可溶性蛋白含量提高73%。利用发酵豆粕可替代仔猪教槽料中的血浆蛋白（4-6%）及保育料中的大豆浓缩蛋白（7.5%）,使经济效益提高65.20%。在泌乳母猪日粮中添加10-15%发酵豆粕可使母猪采食量提高9.21%,并使仔猪断奶窝重、日增重、成活率分别提高24.80%、18.18%、21.98%（P＜0.05）。 5、棉粕等非常规蛋白质饲料的微生物发酵及在动物生产中的应用 利用复合益生菌发酵棉粕,使粗蛋白质含量提高15.76%,可溶性蛋白质含量提高5.7倍,并使棉酚含量大幅度降低。利用米曲霉固态发酵复合劣质蛋白质饲料（棉粕、血粉、羽毛粉） 的研究表明,用7%劣质蛋白质发酵饲料替代豆粕,使猪日增重、日采食量、经济效益分别比对照组提高了8.35%（P＜0.05）、7.83%、9.31%,对于蛋白质饲料资源的开发和利用具有重要意义。 该研究发表科研论文12篇,获发明专利1项。通过在河南德邻生物制品有限公司、河南普爱饲料股份有限公司等单位的推广应用,近三年新增销售额44773万元,具有广阔应用前景及较大社会和经济效益。