[01453022]皮肤表达关键基因QPCR芯片的研制及应用

本项目属于生物检测技术领域,为2010年杭州市科技局立项的杭州市重点实验室科技创新项目。传统基因芯片的突出特点在于高通量、微型化和自动化,但也存在明显的缺点：费用高;难以检测低丰度表达的基因;偏重高通量（一次检测上万个甚至几万个基因）;缺少针对如皮肤、海马组织或某种肿瘤等特定组织类型的表达芯片。生命科学研究的主流在于研究单基因、几个或几十个基因的功能和相互关系,而不是构建全基因组表达谱。对于科研人员来说,除了感兴趣的对象,其它基因不仅干扰实验结果的分析,而且带来高昂的实验成本。基于实时荧光定量PCR技术（Real-Time Quantitative PCR,简称QPCR）,将近百个或数百个QPCR反应设计在一块板子上同时进行扩增,每张QPCR芯片如同上百个QPCR微反应池的集成,每个微反应池都固定有基因特异性引物,当加入含有模板和荧光基团的QPCR反应体系后,在相同的反应条件下,不同的基因都能同时进行特异性扩增,每个微反应池的位置信息就代表了某个特定基因,利用荧光信号的积累实时监测每个微反应池中PCR反应的过程,能同时对上百个基因mRNA进行准确定量分析。本实验室在前期工作中培育了一种DBA背景的稀毛snthr-1Bao小鼠,该小鼠被毛稀疏,上皮与毛囊角化显著,其突变基因已经被定位鉴定为Plcd1功能缺失。本课题尝试开发一种新型的皮肤表达关键基因QPCR芯片,用于探索snthr-1Bao稀毛小鼠突变表型发育的分子病理过程。 本实验成功制备了与皮肤毛发发育相关的176个基因的QPCR芯片。并通过该芯片研究了snthr-1Bao稀毛小鼠的皮肤发育问题,发现存在显著差异表达的基因有Cyp4f15、Itga1、Hgf、Msx2、Cyp26c1、Wnt7a、Hprt、Crabp1、Rbp1、Crisp1、Odc1、Fgf7和Lrat并涉及到Pathways in cancer、Retinol metabolism、Melanoma、TGF-beta signaling pathway和Cytokine-cytokine receptor interaction五条通路。其中参与或调控表皮毛囊形成和发育的主要基因有Wnt5a、Ar、Aldh1a3、Tnf和Fst。基因之间存在显著正相关调控关系的为Krt1与Il19、Hgf,Msx1与Wnt5a、Fst、Crabp1,Ar与Krt35、Wnt5a、Itga1、Crabp1,Krt35与Itga1、Msx2、Crabp1,Tnf与Inhbe,Wnt5a与Fst、Crabp1,Il19与Aldh1a3,Fst与Msx2、Crabp1,Itga1与Msx2、Crabp1、Fgf7和Msx2与Crabp1。存在显著负相关调控关系的为Tnf与Msx2、hprt、Rbp1和Inhbe与hprt。 QPCR芯片作为一项新兴技术,在基因表达水平、病原体及疾病诊断等方面得到广泛运用。国内尚未见针对特定组织类型的从通量角度考虑的QPCR芯片,更没有针对皮肤关键表达基因的QPCR芯片。本项目开发了 “皮肤表达关键基因QPCR芯片”,并对自主培育的snthr-1Bao稀毛小鼠进行检测,为芯片的设计、优化及将来的推广应用提供了坚实基础。该芯片已经与江苏楚天生物科技有限公司合作,开始初步推广应用,该种新型芯片已在十多个研究项目中使用,灵敏度及稳定性均十分突出,在皮肤科学领域有很好的应用前景。