[01609751]肝宁方对肝细胞内质网应激调控研究

1.课题来源 肝宁方对肝细胞内质网应激调控研究（项目编号：81360532）课题于2013年获得国家自然科学基金委员会（地区项目）批复立项,研究期限为2014-01至2017-12,研究期间累计发表论文12篇,SCI论文1篇,中文核心4篇,培养硕士研究生4名,获得中华中医药学会科学技术二等奖1项,超额完成了本课题原预期的成果。 2.项目研究背景 保持内质网稳态是维持细胞生理正常的重要因素。慢性肝脏治疗效果欠佳,肝功能衰竭,全身炎症反应,认为与ERS 有直接的关系。随着对ERS 机制理解的深入,ERS 有望在慢性肝病治疗方面获得新的选择。广西是乙型肝炎的高发区,肝宁方是在中医药理论基础上,结合瑶医药盈亏平衡理论及技术专长,组成具有广西特色的治疗慢性乙型肝炎方药。课题组前期研究表明,肝宁方具有较好的保肝护肝作用,尤其对乙型肝炎后肝硬化取得较好的临床疗效。 3.研究目的和意义 3.1研究目的： （1）从内质网功能、ERS 应激效应、ERS 生存信号途径明确肝宁方对ERS 的影响;（2）基于亚细胞蛋白质组,综合运用比较蛋白质组学和N-糖基化蛋白质组学技术,通过生物信息集成、聚类、关联分析,从细胞代谢、蛋白质质量控制、信号转导网络等不同层次揭示肝宁方对ERS 调控整合机制。 3.2研究意义 （1）基于内质网分析肝宁方对肝细胞的保护作用,同时为中医药基于ERS 途径的肝细胞保护策略提供借鉴。（2）从不同蛋白空间网络阐明肝宁方复杂作用机制。 4.主要研究成果与论据 本课题主要研究衣霉素诱导肝细胞发生ERS后产生的一系列级联反应,从不同方面阐明肝宁方对内质网应激（ERS）调控模式和整合机制。研究发现,在内质网功能方面,肝宁方可以通过调控葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素P450酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V、α-1,2-甘露糖苷酶等,减轻肝细胞内质网应激损伤,减少甘油三酯、胆固醇的脂肪沉积,维持Ca2+稳态;在ERS效应检测中发现内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、生存信号分子（跨膜蛋白肌醇酶1A（IRE1A）、蛋白激酶样内质网激（PERK）和活性转录因子6（ATF6））蛋白表达明显上升,肝宁方对GRP78、IRE1A、PERK、ATF6的表达均有下调作用,阻止未折叠蛋白的错误激活,减轻内质网应激损伤;在内质网比较蛋白质组学研究中,运用蛋白质组学定性定量算法（即Maxquant中的Label free 算法）对各组蛋白质组学数据进行非标记定量分析,用Perseus软件进行统计及生物信息学分析,共鉴定出肽段数15568个,蛋白质组数2430个,将模型组/对照组进行蛋白表达差异分析后,筛选出132个显著差异蛋白（P＜0.05）;在内质网N-糖基化蛋白质组学研究中,N-糖基化蛋白质鉴定结果共2398个,对模型组和对照组蛋白质差异表达筛选（以倍数变化大于2倍或者下调小于0.5,且P＜0.05为标准）,得出55个差异蛋白,对差异蛋白质进行Gene Ontology （GO）功能注释,发现这些蛋白参与了cellular process, single-organism process,biological regulation等重要生物学过程,集中分布于各种细胞中,具有多种分子生物活性,对差异表达蛋白进行KEGG通路注释,经聚类和生物网络分析,得出内质网应激差异蛋白主要位于Protein processing in endoplasmic reticulum,Necroptosis,Alcoholism等重要通路上。肝宁方通过这些差异蛋白及信号通路参与ERS调控,修复内质网中未折叠蛋白或折叠错误的蛋白功能,有望成为慢性肝病治疗新的选择。 5.创见与创新 5.1综合运用比较蛋白质组学和N-糖基化蛋白质组学技术,将不同网络空间蛋白质组群进行整合研究,动态阐述肝宁方方的多途径、多靶点、多环节的多向药理学机制,为符合中医特色的整体性研究方法提供参考。5.2 从蛋白质质量控制角度研究肝宁方作用和机制,既体现肝宁方对内质网本质的影响,也为中药复方研究提供值得探索的方向。 6.社会经济效益,存在的问题 因有效性、安全性、经济性、适宜性、可推广性等,被遴选为广西卫生厅30 项中医特色适宜技术之一,在广西南宁、柳州、百色等不同地区基层乡镇卫生院,社区,基层中医院推广应用,通过问卷调查,患者满意率为89.6%。同时也存在一些问题,如对肝宁方有效成分和作用机制仍需进一步行深入研究,增强临床可重复性,提高疗效;在申请新药,为更多的慢性肝炎患者提供治疗方面仍有较长的路要走。 7.历年获奖情况 “中医药治疗乙型肝炎-肝硬化-肝癌系列研究及应用”获得中华中医药学会科学技术奖,二等奖。