[01636491]鱼腥藻新型生物反应器的研制及玉米黄素和隐黄素的生产

玉米黄质是自然界中常见的一种β-胡萝卜素衍生物,科学家早就发现玉米黄质黄斑和视网膜中最关键的部分,能保护眼睛的黄斑区免受光氧化损伤,尤其是维持黄斑区域的内消旋玉米黄质结构密度,对老年黄斑退行病具有很好预防作用。同时玉米黄质作为强抗氧化剂,能够帮助细胞抵御自由基的伤害。玉米黄质虽然存在人体中,但不能通过人体合成,必须从食物或营养补充剂中获得。自然界中的玉米黄质含量很少,远不能满足市场需要。玉米黄质是通过一系列酶作用合成,其中β-胡萝卜素羟化酶（CHYB）是玉米黄质合成过程中一个关键限速酶。因此从分子水平上研究β-胡萝卜素羟化酶转录调控机制及通过基因工程来生产玉米黄质,是玉米黄质的合成研究的新趋势。 本项目采用RACE方法首次扩增出盐生杜氏藻（Dunaliella salina） β-胡萝卜素羟化酶（chyb）基因,该基因全长1433 bp,包含一个969 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,包含有4个保守的组氨酸基序,与团藻（Volvox carteri f. Nagariensis）及莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的同源性分别是64%和58%。序列分析表明,盐生杜氏藻CHYB具有四个跨膜结构及叶绿体导肽,进一步证明该酶定位于叶绿体类囊膜上。系统进化树分析标明,盐生杜氏藻CHYB与其他绿藻如团藻、莱茵衣藻的CHYB共处一个进化支,亲缘关系很近。盐生杜氏藻chyb基因的表达调控研究显示,在经强光刺激24 h后, 盐生杜氏藻chyb基因表达显著上调（P＜0.01）,在48 h表达最高（P＜0.01）。在经乙酸钠、硫酸亚铁和强光共同处理6 h时,chyb基因表达急剧上升（P＜0.01）,处理12h 后下降。高效液相色谱测定其玉米黄质,结果显示,三组处理均能提高盐生杜氏藻的玉米黄质的含量,葡萄糖处理效果最明显,其玉米黄质含量比对照组增长53%（P＜0.01）。 将盐生杜氏藻chyb构建到穿梭表达载体pRL25C上,通过三亲接合方法进行转化鱼腥藻7120（Anabaena sp. PCC 7120）,经卡那硫酸青霉素筛选得到遗传形状稳定的转基因鱼腥藻7120,DNA分子检测初步证明重组质粒pRL25C-chyb已经转入鱼腥藻7120。高效液相色谱测定野生型鱼腥藻和转基因鱼腥藻的玉米黄质,结果显示转基因鱼腥藻7120中玉米黄素含量相对于野生型对照组含量增加了59%,经强光处理后,转基因鱼腥藻玉米黄素含量是强光野生藻含量的2.9倍（P＜0.01）,为正常光下野生藻含量的3.8倍（P＜0.01）。 本工作可能为玉米黄质合成调控提供理论指导,同时也为藻类生物反应器的建立及广泛应用打下基础。