[01704059]新型宏基因组文库和新型酶资源技术体系创建及其在医药行业应用

医药用新型稀缺酶资源研发具有重要价值。在绿色制药上,酶催化条件温和、高效环保;在疾病诊治方面,酶制剂安全性和特异性高;但存在来源局限,酶活不高、半衰期短等难题。项目组在国家自然科学基金及浙江省重大科技专项支持下,创建新型宏基因组技术、连续定向进化技术、超低温微波固定等系列创新技术。经十多年研究,取得如下创新成果。 1、创建基于DNA-shuffling宏基因组新酶稀缺资源开发技术并应用于Enzyme Tool Box制备 采集全国60多种极端环境来源的土壤样品,构建总库容为4×1010 bp的宏基因组文库,提供丰富酶基因资源。创建基于DNA-shuffling的宏基因组新酶开发技术,为Enzyme Tool Box制备提供了新方法。构建多种新型酶库（总计300多种新酶）,如醛缩酶、糖基转移酶、酮还原酶、酯酶、葡萄糖脱氢酶及葡萄糖氧化酶等。 2、创建酶工程迭代优化、超低温微波辅助酶固定化和三维固酶限域空间等新技术 创建酶工程迭代优化新技术,克服酶-底物结构信息准确性、计算能力及精度不足的难题,采用半经验量子力学-分子力学混合方法,使丁酰胆碱脂酶降解可卡因效率提升三个数量级。 创新采用超低温微波辐射,促进酶分散和载体内传输,减少共价连接活化能和表观反应时间,揭示“非热效应”对酶结构的作用机理。借助二元固定法制备固定化多酶微胶囊体系,在载体内构建“代谢区室”,并阐明原理。 创新采用梯度膜孔物理嵌套和仿生磷脂两性分子局部吸附技术,实现酶表面固定和活力保持。建立纳米金属配合多孔膜为载体的配位法酶固定技术,创造了三维固酶限域空间。研发成功新型三维固酶植入式连续血糖传感器,为糖尿病人血糖连续监测及个体化治疗奠定技术基础。 3、创建若干药物及中间体的酶法绿色制备新工艺 从新型酶库筛选出新型酯酶进行优化改造,通过酯酶对植物油高效定向改性,用于天然类胡萝卜素等绿色生产工艺。该成果列入国家标准和美国药典。 榄香烯是谢恬团队研发的治疗肺癌、肝癌等具有知识产权的抗癌新药。从新型酶库筛选出高效稳定的糖苷酶,构建酶法制备榄香烯糖苷和寡肽衍生物工艺,发现对脑胶质瘤抑杀活性提高三倍以上。 从新型酶库中筛选出酶学性质优异的醛缩酶,实现一次引入双手性碳原子的经典反应,应用于他汀类药物侧链酶法绿色工艺,原料投入减少80%,有机溶剂减少70%。筛选出立体选择性高的（R）/（S）-酮还原酶,研发出双酶耦合辅酶再生体系制备手性药物中间体 （R）/（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工艺,ee值都达到99%以上。 4、研究发现丁酰胆碱酯酶为关键切入点,合理设计高活性突变体和高稳定性酶制剂,用于可卡因成瘾和中毒的治疗 研发出第一个长效可卡因水解酶,催化效率高、半衰期长。首次发现可卡因主要有毒代谢物苯甲酰芽子碱（BE）的水解酶。采用计算机辅助设计和酶工程结合新策略,改造BE水解酶,酶活提高18倍,用于治疗可卡因的长期毒性。 以上成果获发明专利9项,发表SCI论文51篇,其中JCR一区12篇、二区17篇,包括PNAS、Nat. Commun.、Nucleic. Acids Research、Journal of Materials Chemistry B、ACS Chem. Biol.、Org. Lett.、Biosen. ＆ Bioelectron.及Nat. Biotechnol.等顶尖期刊,总影响因子大于250,他引1000多次。培养研究生70多名。近三年新增销售额20多亿元,新增利润2.3亿元,取得显著社会效益、经济效益和生态效益。 中国医药生物技术协会组织桑国卫院士、魏于全院士、陈凯先院士、樊代明院士、杨宝峰院士、王广基院士及孙汉董院士七位院士成立科技成果评价委员会,评价意见认为本成果达国际先进、国内领先水平。