[01764801]新型农用抗生素分离纯化与发酵工艺研究

1)成功筛选到能够分泌抗革兰氏阳性菌及植物病害真菌的物质的菌株，此菌株为链霉菌Streptomyces regensis新变种，通过物理、化学方法诱变，筛选得到分泌能力更强的菌株。2)采用正交实验设计方法优化了发酵培养基的组成，优化后单位发酵液的活性提高了18.9倍。发酵培养基组成(g/l)：葡萄糖5、玉米淀粉40、黄豆饼粉16、玉米浆2ml、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O0.5、NaCl0.5、淀粉酶0.05、起始pH6.0。3)在2L，5L和30L全自动发酵罐上进行培养工艺研究，最终确立了菌株在30L发酵罐的批式发酵条件为：搅拌转速560rpm，通气量1.0-1.2vvm，发酵周期为72小时。4)对新型抗生素的抗菌谱进行了研究，发现此物质不仅对农业多种植物病害真菌具有显著的抑制作用，还对肺炎球菌、化脓链球菌、粪链球菌等革兰氏阳性菌具有显著活性，新型抗生素还具有抗肿瘤的活性，评价结果表明，此物质对人白血病细胞L1210、非小细胞肺癌细胞PG-49的细胞毒性IC50值分别小于10-11M、10-12M，比同条件下测定紫杉醇(paclitaxel,Taxol?)和紫杉替尔(docetaxel, Taxotere?)的活性高出100-1000倍，具有显著的抗肿瘤活性。5)建立了定量分析此物质的方法，以甲醇：水：离子对试剂A为72：25.5：2.5为流动相、流速为1.0ml/min、检测波长为330nm反相离子对高效液相色谱，有效成分在5.3min左右出峰，每个分析样品运行7-10min即可分析结束；检测方法在样品0.3-500μg/ml范围具有良好的线性、精确性、准确性和回收率。6)采用溶媒浸取、大孔吸附树脂层析、沉淀、反相层析等方法相结合，得到了新型抗生素的分离纯化方法，回收率达到72.6%。7)采用13C-NMR、H-NMR、DEPT及两维NMR中的COSY、HMQC、HMBC等、快原子轰击质谱(FAB)、电喷雾质谱(ESI)、串联质谱(MS/MS)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)等多种现代波谱学方法与化学方法相结合，鉴定了此活性物质的化学结构，其分子式为C32H45N2O9，分子量为600Da，该结构化合物未见文献报道。研究完成论文多篇：①石炳兴，赵红，刘喜朋，元英进，胡宗定；抗生素AGPM发酵培养基的优化；过程工程学报，2001，4。②石炳兴，刘喜朋，赵红，元英进，胡宗定；抗生素AGPM的摇瓶发酵条件的正交实验优化；第九届全国生物化工学术会议论文集，天津，2000，10，134-136。③刘喜朋，石炳兴，元英进；一种抗真菌蛋白的发酵动力学研究；第十届全国化学工程技术报告会论文集；郑州，2000，5，966-969。④石炳兴，李景川，元英进，胡宗定；抗生素药物面临的挑战与机遇(综述)，中国抗生素杂志(submitted).⑤Shi Bing-Xing, Yuan Ying-Jin, Hu Zong-Ding; AGPM, novel antibiotic from Streptomyces sp. 099: I.Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical properties and biological activities. (in preparation).⑥Shi Bing-Xing, Yuan Ying-Jin, Hu Zong-Ding; AGPM, novel antibiotic from Streptomyces sp. 099: II. Structure elucidation. (in preparation). ⑦Shi Bing-Xing, Li Xiao-Feng, Yuan Ying-Jin, Hu Zong-Ding; Development of a direct reversed-phase ion-pair high performance liquid chromatographic method for the determination of new antibiotic AGPM. (in preparation).⑧申请中国专利一项：一种抗肿瘤抗生素及其微生物发酵制备方法，中国专利，申请号：01141443.X。