[01810358]食源性病原微生物的特异性快速、高效检测技术与应用

民以食为天,食品安全是关乎国计民生的重要问题,收到各国的广泛重视。开展食源性病原微生物的检测是保证食品安全的重要环节。面对数量巨大、种类繁多的食源性病原微生物,如何进行有效的检测监测是食品安全面临的重要难题。我国目前的食品致病菌的检测大多还停留在传统的方法上,包括微生物培养、微生物染色后镜下形态观察、生化反应试验、功能特性检测等,此类检测工作量大,耗时长,技术要求高,特异性及灵敏度有待提高,难以满足大量食品样品快速检测的现实要求。开展高效特异快速的微生物检测是解决这一问题的关键。 课题来源于与企业的横向合作,并获得多个省市级科研项目支持,包括： ①食源性病原微生物特异高效检测技术研究与应用（201120637175-5,武汉市科技局科技攻关计划项目,2011）; ②EHEC（stx+/Stx-）基因调控和致病性研究（教育部留学回国人员科研启动基金资助项目,教外司留20111139,2011）; ③食品中肠出血性大肠杆菌快速检测关键技术研究（2013030409020113,武汉市科技局国际科技合作项目,2013）; ④Investigation of non-O157 Shiga-toxin producing E. coli contamination of commercially available raw meat（日本九州大学国际科技合作项目,2013年）; ⑤Investigation of Shiga-toxin producing E. coli contamination of commercially available raw meat and raw vegetables in central China（日本九州大学国际科技合作项目,2011年）; ⑥家禽酱卤制品微生物的污染及其控制技术研究（编号 201120722199,武汉市重点科技攻关计划项目,2011）; ⑦一种新发现的大肠杆菌致病菌志贺毒素调控机制研究（Q20111710,湖北省教育厅优秀中青年人才计划项目,2011）; ⑧茶多酚EGCG协同抑制大肠杆菌O157的转录响应分析（湖北省教育厅重点科研计划项目,2015）; ⑨食源性致病菌蜡样芽孢杆菌在食品加工中的检测和食品安全性（中国-丹麦政府间科技合作项目,国科外字[2010]329号. 2011）⑩ 肉制品中高危害性致病菌的快速检测（Q20111703,湖北省教育厅科学研究计划项目中青年项目,2011）。LAMP针对靶基因设计4种特异引物,利用链置换反应,在等温条件下快速扩增目标区域的快速高效检测。最低检出限（cfu/mL）分别为：猪霍乱沙门氏菌13.3、肠炎沙门氏菌23.3、溶血性链球菌16.7、阪崎肠杆菌3、金黄色葡萄球菌20、致病性蜡样芽胞杆菌11。 多重PCR检测是在一个PCR反应中完成志贺毒素编码基因（stx）和O157特征基因的检测,并能鉴别stx基因及其常见亚型、具有特异性、广谱性。 朊病毒的免疫印迹检测通过克隆表达朊病毒特征蛋白片段,获得抗原,制备相应抗体。同时,通过建立亲和层析分离、浓缩体系及蛋白印迹检测靶蛋白。检出限为：2 pmol/L,可用于牛肉制品中疯牛病病原检测。 （1）本项目成果完成了常见病原微生物的LAMP检测技术研究,原理具有通用性。其中的典型代表：致病性蜡样芽胞杆菌（含呕吐毒素）已获得国家发明专利。因此,项目成果在国内具有创新性、先进性。 （2）朊病毒的免疫印迹检测方法研究填补了我国在这一领域的研究空白,对防范疯牛病危害具有重要意义。该技术方法及试剂已获得国家发明专利,因此,具有创新性、先进性及独立知识产权。 （3）针对产志贺毒素大肠杆菌的多重PCR检测方法提出的“产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用”已申报专利,能实现对大肠杆菌特定毒株（如O157：H7 EC 5.11）的stx2c亚型分型鉴定。具有独创性和先进性。项目研究已经完成,技术已经成熟。研制的产品已在相关企业单位试用。结果表明：产品具有快速、灵敏、特异、准确的特点。对环境和操作人员没有危害,试用是安全可靠的。产品可广泛用于食品生产单位的产品生产、流通、消费等各个环节,以及各级检测部门的日常检测、监测。主要问题是产品相对于传统检测方法,成本比传统产品高,用户接受有一个过程。另外,技术推广应用也需要相应的政策支持。技术上也有一个导入与培训的过程。无