[01918271]PELSA: 用于靶标鉴定的蛋白质组学新方法

一、PELSA 技术介绍

解析配体 - 蛋白相互作用有助于全面揭示配体分子的生理功能和作用机制，进而为疾病治疗 以及药物研发提供新的思路。由于蛋白质并非均一的整体，大多数配体与蛋白的结合仅发生在蛋 白质的局部区域。鉴定配体结合区域能够直接为药物研发提供可供结合的位点， 同时为深入研究 药物 - 蛋白构效关系提供重要指导。根据配体结合会导致蛋白质结合区域稳定性的改变进而影响 酶切效率的原理，我们团队发展了一种肽段为中心的蛋白局部稳定性探测技术（PEptide-centric Local Stability Assay, PELSA）用于配体结合蛋白、结合区域的鉴定以及局部亲和力的测定。我们 在国际范围内对 PELSA 拥有自主知识产权。PELSA 是目前基于配体免修饰类方法中具有最高灵 敏度的技术，是研究配体 - 蛋白质相互作用的利器 !

二、PELSA 技术原理

PELSA 技术基于配体结合蛋白微区域对酶切具有更高的耐受性而建立的。通过深度酶切策 略，可以直接从蛋白质的天然结构状态中产生小肽段，来代表蛋白的稳定性。然后将这些小肽段与 未被酶切的蛋白大片段分离开来。通过定量蛋白质组学鉴定丰度改变的肽段，通过分析这些差异 肽段对应的蛋白质及其在蛋白质中的位置，可以在整个蛋白质组尺度上确定发生能量状态变化的 蛋白质和蛋白质区域。

图 1. PELSA：肽段为中心的蛋白局部稳定性探测技术

三、PELSA 技术特色

1、不需要对配体进行化学修饰， 提高数据真实性，降低鉴定结果的假阳性；另外对于不能进 行化学修饰小分子结合蛋白的鉴定十分友好；

2、通过检测蛋白质丰度和结构变化两个维度信息，可同时获得配体结合蛋白和结合位点信 息，具有高特异性和高灵敏度特点。如果加入药物浓度维度，还能够同时获得基于肽段的局部亲和 力信息；

3、样品复杂度低， 能够鉴定到大量包含配体结合信息的肽段。显著放大蛋白对配体结合的响 应，具有极高的灵敏度；

4、通过结合基于 DIA（数据非依赖采集）的质谱定量技术，具有高通量，高分辨率和高覆盖率 的特点；

5、能够广泛应用于多种类型配体（药物、中药单体、天然产物、代谢物、金属离子和环境污染物 等）结合靶标蛋白的鉴定，并可在细胞裂解液和组织层次实现。

四、PELSA 相对 LIP-MS 及其它免修饰方法的优势

与已有的限制性酶解 - 质谱分析（LiP-MS）方法相比将大大降低样品的复杂度，PELSA 能鉴 定到更多对配体有响应的肽段，更重要的是，PELSA 能明显放大配体结合区域靶蛋白的响应，灵敏 度比 LiP-MS 高 10 倍以上。

图 2. PELSA 和 LiP-MS 对药物 MTX 和 SHP099 靶蛋白鉴定效果的比较

与目前国际上最先进的能鉴定配体结合蛋白和结合区域的限制性酶切方法 LiP-Quant 技术 相比，鉴定靶蛋白的灵敏度提高了 12 倍；与目前世界上最广泛使用的鉴定配体结合蛋白的 蛋白质热转移分析方法（TPP）相比，该方法的灵敏度是其 2.4 倍。

图 3. PELSA 与其它免修饰方法对 Staurosporine 靶标的鉴定

五、PELSA 技术可应用领域

1、药物、中药单体、天然产物等小分子结合靶点蛋白的发现，促进新药研发，揭示其作用机制；

2、药物脱靶蛋白鉴定，揭示副作用机制和药物重新利用；

3、疾病生物标志物的发现（如神经退行性疾病中淀粉样蛋白 / 可溶蛋白的比例）；

4、小分子 - 蛋白、蛋白 - 蛋白、代谢物 - 蛋白、环境污染物 - 蛋白相互作用、位点鉴定及网络分 析；

5、研究翻译后修饰与蛋白结构和功能的相关性。

六、提供配体 - 蛋白互作及位点检测（PELSA）服务

通过分析对配体有响应的差异蛋白和肽段，筛选配体候选结合蛋白并解析结合位点；当结合 配体剂量依赖实验时，同时能获得候选蛋白的亲和力信息 - 下图是以 lapatinib 药物（已知靶标蛋 白 ERBB2）为例：能够得到候选蛋白相应肽段在整个肽段层次上的分布（a）；候选蛋白在整个蛋 白层次上的分布（b）；对 lapatinib 药物有响应肽段在对应蛋白结构域上的稳定性分析，揭示结合 位点（c），间接验证筛选候选靶标蛋白的可信度；候选蛋白鉴定的所有肽段在药物剂量依赖条件 下的微区亲和力（d）。

图 4.PELSA 方法用于分析药物结合靶蛋白、结合位点和局部亲和力