[00338098]重组大肠杆菌生产磷脂酶 D 及转酯化产品开发
联系人：凌雪萍
所在地：福建厦门市
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技术详细介绍
一、项目简介
磷脂酶 D（PLD， EC 3。1。4。4）是一类广泛存在于各种生物体的酶，具有水解作用和磷酰基转移作用（见图 1）。作为一种酶制剂，PLD 的转磷脂酰活性尤为重要，被用于制备具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰胆碱（PC）为底物， PLD 酶法制备磷脂酰丝氨酸（PS），受到广泛关注。PS 作为脑健康营养补充剂，相继被美国 FDA、日本 HBM 和中国国家卫生计生委所认证，列为新资源食品。相较于提取自牛脑和植物的 PS，生物酶法制备的 PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过 PLD 转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂类似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰丝氨醇，它们中一些具有抗癌和抗氧化活性。
二、技术成熟度
直到现在， 受限于磷脂酶 D 来源不足和价格高（ 链霉菌属 PLD ，
≥150 units/mg， 6516。9 ￥/1000 U，Sigma 公司），其工业上的广泛应用受到限制。例如，文献报道的 PLD 最高产量在 104-105 U·L-1，而制备转化得到每公斤 PS，需要 2。6×106 U 的 PLD。这一障碍的主要原因是高水平表达的 PLD 对宿主的严重细胞毒性，导致细胞死亡。
历经 5 年时间，从上游到下游整体设计，我们解决了毒性蛋白（磷脂酶 D， PLD）异源表达难的问题（质粒不稳定、蛋白合成时间短、细胞生长抑制和裂解）， PLD 生产达到目前世界最高水平 106 U·L-1 （748 mg·L-1）（提高 20 倍）；同时发展一种简单有效提取重组磷脂酶 D 的方法（无需破碎、无需添加溶菌酶和有机溶剂、室温进行），PLD 生产成本有望降低 20 倍以上。按照实验室规模的一台 5 L 发酵罐，年产量可以提供 3。5×108 U 的磷脂酶D，满足 100 kg 的 PS 转化需求计算（不计算 PLD 重复利用率），扩大反应器体积至 100-1000 L，PLD 产量可满足制备 2- 20 吨 PS 的需求。
三、应用范围
经 PLD 酶法制备的 PS、磷脂酰熊果苷等可广泛用于功能食品、药品、化妆品及农牧业等领域。
四、投产条件和预期经济效益
本技术通过微生物发酵生产 PLD，菌株表型稳定，原料易得。生产过程不污染环境。对于年产 109 U PLD （1kg）的规模，预计设备投资 50 万元（两台 10 L
发酵罐），年销售额 1000 万元。
五、合作方式
技术转让或联合生产，具体合作方式可商议。
磷脂酶 D（PLD， EC 3。1。4。4）是一类广泛存在于各种生物体的酶，具有水解作用和磷酰基转移作用（见图 1）。作为一种酶制剂，PLD 的转磷脂酰活性尤为重要，被用于制备具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰胆碱（PC）为底物， PLD 酶法制备磷脂酰丝氨酸（PS），受到广泛关注。PS 作为脑健康营养补充剂，相继被美国 FDA、日本 HBM 和中国国家卫生计生委所认证，列为新资源食品。相较于提取自牛脑和植物的 PS，生物酶法制备的 PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过 PLD 转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂类似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰丝氨醇，它们中一些具有抗癌和抗氧化活性。
二、技术成熟度
直到现在， 受限于磷脂酶 D 来源不足和价格高（ 链霉菌属 PLD ，
≥150 units/mg， 6516。9 ￥/1000 U，Sigma 公司），其工业上的广泛应用受到限制。例如，文献报道的 PLD 最高产量在 104-105 U·L-1，而制备转化得到每公斤 PS，需要 2。6×106 U 的 PLD。这一障碍的主要原因是高水平表达的 PLD 对宿主的严重细胞毒性，导致细胞死亡。
历经 5 年时间，从上游到下游整体设计，我们解决了毒性蛋白（磷脂酶 D， PLD）异源表达难的问题（质粒不稳定、蛋白合成时间短、细胞生长抑制和裂解）， PLD 生产达到目前世界最高水平 106 U·L-1 （748 mg·L-1）（提高 20 倍）；同时发展一种简单有效提取重组磷脂酶 D 的方法（无需破碎、无需添加溶菌酶和有机溶剂、室温进行），PLD 生产成本有望降低 20 倍以上。按照实验室规模的一台 5 L 发酵罐，年产量可以提供 3。5×108 U 的磷脂酶D，满足 100 kg 的 PS 转化需求计算（不计算 PLD 重复利用率），扩大反应器体积至 100-1000 L，PLD 产量可满足制备 2- 20 吨 PS 的需求。
三、应用范围
经 PLD 酶法制备的 PS、磷脂酰熊果苷等可广泛用于功能食品、药品、化妆品及农牧业等领域。
四、投产条件和预期经济效益
本技术通过微生物发酵生产 PLD，菌株表型稳定，原料易得。生产过程不污染环境。对于年产 109 U PLD （1kg）的规模，预计设备投资 50 万元（两台 10 L
发酵罐），年销售额 1000 万元。
五、合作方式
技术转让或联合生产，具体合作方式可商议。