[00354772]乳铁蛋白多肽在酵母表达系统中表达及产业化技术研究

1、课题来源及背景：本项目为浙江省重点农业项目。饲用抗生素的长期使用，不仅造成耐药性菌株的产生和残留，导致动物源性食品的安全面临严峻问题，更严重的是随动物粪便排泄到环境中而造成的对整个生态的破坏。因此，创制新型、安全和高效的防病、保健和促生长的添加剂并尽快产业化就显得尤为重要和迫切。2、应用领域和技术原理：本项目针对浙江省饲料工业和养殖业中存在抗生素等添加剂滥用严重、畜禽和水产品安全性差等一系列重大难题，采用基因工程技术、微生物发酵技术等高新手段，利用毕赤嗜甲醇酵母表达系统成功表达了猪乳铁蛋白多肽(PLFN)基因，表达产物对大肠杆菌、沙门氏菌具有抑制效果。本研究进一步对表达重组猪乳铁蛋白多肽(rPLFN)的基因工程菌进行了小试发酵和中试生产工艺研究，通过中试生产得到了含0.1%表达产物的产品，将其应用于断奶仔猪的饲养试验，结果表明该产品提高了断奶仔猪的生长性能和免疫功能。3、性能指标：1）本项目中猪乳铁蛋白多肽(rPLFN)在毕赤酵母表达系统中的表达量为19.9mg/L，超过了预期指标12～15mg/L；2）中试发酵生产的rPLFN产品能明显提高断奶仔猪的免疫功能，降低腹泻率44.27%，仔猪日增重提高16.25%，料重比下降了11.76%，达到了预期目标；3）本项目及相关研究结果在SCI收录期刊上发表论文9篇，一级学报论文1篇，申请专利3项，授权1项。4、与国内外同类技术比较：乳铁蛋白及其多肽具有广泛而独特的生物学功能和理化特性，在饲料工业中应用前景十分广阔。比如可耐受较高温度，使之在加工过程中不易变性失活；具有广谱的抗菌、抗病毒作用，可预防和治疗仔猪腹泻；具有调节免疫系统活性的作用，可增强家畜对疾病的抵抗力；具有抗真菌和抗脂质氧化作用，可用作防霉剂和抗氧化剂等。最重要的是乳铁蛋白及其多肽对细菌的作用机理独特，细菌不易对其产生耐药性，与传统的抗生素相比，使用起来更加安全。但是由于乳铁蛋白及其水解产物价格昂贵，目前尚未见到有关乳铁蛋白多肽用于畜禽试验的报道。毕赤嗜甲醇酵母(P.methanolica)表达系统是一种最近发展起来的酵母表达系统，它以AMG1强启动子为表达启动子，外源蛋白的表达量高，适合于表达对细胞有毒性的外源蛋白，能对重组蛋白进行翻译后的剪接，正确的折叠和修饰，糖基化也更接近高等真核生物，比其它酵母、乳腺表达系统和杆状病毒等真核表达系统更具有优势，不但操作简便，成本低廉，而且更加适合工业化生产。利用甲醇毕赤酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白多肽及其产业化技术研究在国内外尚属空白。国外相关研究集中在人和牛乳铁蛋白(LF)或多肽上，主要集中在抗菌功能及机制研究、LF的基因调控与重组表达研究方面。目前，猪乳铁蛋白(PLF)重组表达研究的报道非常少，本课题组已利用杆状病毒表达系统，在家蚕蛹中成功地表达了PLF，表达产物虽有一定的抗菌活性，但抗菌活性并不强（因为猪乳铁蛋白本身的抗菌活性远没有猪乳铁蛋白多肽强）。关于“利用甲醇毕赤酵母表达系统表达高抗菌活性的重组猪乳铁蛋白多肽及其产业化技术研究”目前还未见报道。5、成果的创造性和先进性：（1）用毕赤嗜甲醇酵母表达系统表达乳源生物活性因子——猪乳铁蛋白多肽，生产具有抗菌和免疫功能的rPLFN产品并应用于仔猪饲料；（2）研究该产品对仔猪免疫功能的影响；（3）从仔猪的重要先天免疫因子抗菌肽基因表达上研究猪乳铁蛋白多肽对仔猪免疫的影响。6、作用意义：长期使用抗生素造成的细菌耐药性和药物在畜产品中的残留，不仅给畜禽生产造成十分不利的影响，而且给人类健康带来严重的威胁。因此如何提高畜禽先天免疫力（抗菌肽是畜禽体内非常重要的先天免疫因子）和创制新型安全高效的抗生素替代物（抗菌肽）是目前我国乃至国际上动物营养与饲料科学研究的当务之急。本项目采用基因工程技术、微生物发酵技术等高新手段，利用毕赤嗜甲醇酵母表达系统成功表达得到了rPLFN产品，并进一步进行了小试发酵和中试生产工艺研究，得到的产品对大肠杆菌等具有较好的抗菌效果，且能明显提高断奶仔猪的生长性能和免疫功能。因此，它的开发利用具有广阔的前景，这对推动绿色、安全的畜禽保健促生长添加剂的研制，从真正意义上推进饲料“无抗生素化”进程和生产安全、营养、优质的肉、蛋、奶具有重要的科学意义。