[00385258]HPV16 E7结合亲和体分子及其affitoxin对宫颈癌的靶向治疗研究

尽管基于HPVL1蛋白的病毒样颗粒疫苗已经商业化用于预防宫颈癌的发生，并且效果显著，但对已经感染HPV或宫颈细胞已经发生了病变的组织如CIN及宫颈癌，并没有效果。宫颈癌在全球女性人群中发病率和死亡率仍然居高不下，迄今尚无特异性治疗方法。基于单克隆抗体的分子靶向治疗为肿瘤的生物免疫治疗开创了崭新的途径，但仍有一些问题尚待解决，如毒副作用大和价格昂贵等。研究发现，来源于葡萄球菌蛋白A亲和体(affibdoy)分子与靶蛋白具有高亲和力的特异性结合特点，同时由于分子小、免疫原性低等特性，在分子靶向治疗及体内成像诊断等方面，具有优于抗体的特点。该研究针对上述问题开展研究，以葡萄球菌蛋白A亲和体(affibdoy)分子为基础，通过分子生物学和噬菌体展示技术，筛选了HPV16 E7结合亲和体分子(ZHPV16 E7 affibody)，并通过蛋白水平、细胞水平和荷瘤裸鼠(动物水平)对筛选的affibody分子的分子靶向结合特异性及肿瘤生长抑制作用进行了验证，为增强对靶细胞的杀伤作用，利用修饰的绿脓杆菌外毒素(PE38KDEL)，制备HPV16 E7特异性亲和体携带细菌毒素的重组蛋白(ZHPV16 E7 affitoxin),进一步对ZHPV16 E7 affitoxin与靶蛋白HPV16E7的结合特异性及其靶向肿瘤的杀伤活性，在蛋白水平、细胞水平及荷瘤裸鼠的在体水平进行了研究和论证。获得了下述研究成果：构建了ZHPV16 E7 affibody的随机组合噬菌体展示文库；通过多轮筛选和测序技术，获得了ZHPV16 E7 affibody分子65个，选择了其中的4个(ZHPV16 E7:127，ZHPV16 E7:301，ZHPV16 E7:384，ZHPV16 E7:745)进行了原核表达，并制备了纯化蛋白；利用分子克隆和原核表达系统制备并纯化了ZHPV16E7 affitoxin蛋白；利用SPR技术在蛋白水平验证了筛选的ZHPV16 E7 affibody和ZHPV16E7 affitoxin分子与HPV16 E7蛋白具有极高的亲和力；利用免疫荧光共定位技术在细胞验证了筛选的ZHPV16 E7 affibody和ZHPV16E7 affitoxin分子分子特异靶向宫颈癌细胞表达的HPV16 E7蛋白；利用小动物成像技术在动物在体水平验证了ZHPV16 E7 affibody和ZHPV16E7 affitoxin分子分子具有快速靶向HPV16阳性肿瘤的特性；对affibody及affitoxin的生物学特性进行了研究：半衰期、LD50和IC50等。ZHPV16 E7 affitoxin蛋白对宫颈癌荷瘤裸鼠的治疗作用：成功建立了裸鼠宫颈癌细胞荷瘤模型；验证了ZHPV16 E7 affitoxin蛋白对致瘤作用具有显著的抑制作用；验证了ZHPV16 E7 affitoxin蛋白显著的靶向抑瘤作用，且毒副作用不明显。该研究为发展基于ZHPV16 E7 affibody的宫颈癌特异性靶向治疗和靶向成像诊断提供了新途径，极具应用前景。研究成果多次参加国内外学术会议交流。申报发明专利2项；发表论著9篇(SCI论文3篇), 2篇论文分别正在评审和总结中；培养博士生1人，硕士研究生8人。