[00710328]一种黄牛肠激酶催化亚基的基因工程生产方法及其应用

一、技术和市场背景：基因工程实践中经常使用融合表达进行目标蛋白质的表达、生产。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性质，融合表达能大大简化、方便产物的检测，性质研究和分离纯化。但这同时也带来了新的问题，即融合蛋白的特异性去除问题。当重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时，目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工。目前国际上最常用的工具蛋白酶为：凝血酶，因子Xa和肠激酶，其中肠激酶和Xa切割后的产物和天然产物完全一致，而凝血酶切割后的产物比天然产物分别多二个氨基酸。目前使用的这些蛋白酶都是从天然来源分离、纯化的，得率低，价格昂贵，而且全部为进口产品，因此在大规模生产运用时，无疑会大大增加成本。因此用基因工程方法生产这些工具蛋白酶已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需。用基因工程方法生产肠激酶不仅能极大地降低成本，而且有效去除杂质蛋白酶、提高纯度，替代进口。二、成果的先进性和市场前景：该专利发明了一种在末端添加了组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，该黄牛肠激酶催化亚基在毕赤氏酵母中获得了分泌性表达，经过Ni2+亲和层析一步分离纯化、制备获得带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，它能够特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物，具有高效、价廉的特点，能够作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。重组EKL-His的酶活性并没有因His-tag受到影响，甚至远高于商品化的EKL(Roche)的活性。该发明专利生产的重组肠激酶催化亚基-His6，其分离纯化方法非常简易、方便，而且由于其带有His-tag，极大方便了酶切反应完成以后肠激酶催化亚基的去除，从而最大程度地减少目标蛋白的污染。由于目前商品肠激酶的昂贵价格和在生物化学和分子生物学、生物工程、生物工程制药产业研究与开发中的广泛应用，该发明设计的中国黄牛肠激酶催化亚基-His6及其甲醇毕赤酵母表达菌株的构建、以及其分离纯化工艺具有广阔的实用前景。三、生产条件和成本：该技术已经完成表达菌株的构建，建立了生产工艺，已经生产出一批产品在本实验室试用。成本约为实际售价的10-20％。