[00722062]阿特拉津氯水解酶基因的分离、改造及转基因烟草的获取

阿特拉津是一种在世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂，中文商品名为莠去津，用于玉米、高粱、甘蔗等作物的杂草防除。国外使用该除草剂已有50年历史，中国从80年代初开始使用。虽然阿特拉津是一种中等偏低毒性的除草剂，但由于其使用量大、残留期长(半衰期为244天)、污染范围广(水环境、土壤、大气)、对人和哺乳动物可能有致癌作用，所以被列为环境荷尔蒙(内分泌干扰剂)的可疑物质。中国的阿特拉津污染形势十分严峻。北京市备用水源官厅水库的阿特拉津含量已达到临界值(0.67-3.9 ug/L)。农田中残留的阿特拉津对后茬作物如小麦、大豆、谷子和甜菜等造成毒害。第一个阐明阿特拉津生物降解分子机制的是美国明尼苏达大学的Wackett-Sadowsky联合实验室，第二个阿特拉津氯水解酶基因(AD1-atzA)分离是该课题组完成的。课题组从农药厂废水中分离到能以阿特拉津为唯一氮源生长的节杆菌(Arthrobacter)AD1菌株，该菌株对阿特拉津的降解速率明显高于美国报道的假单胞菌ADP菌株。生化和遗传学分析表明，AD1菌株只含有阿特拉津降解途径的全部基因的前3个基因(atzA、atzB、atzC)，其atzA基因与ADP菌株的atzA基因相比，仅有1个核苷酸不同，ADP菌株atzA基因的第832位碱基是腺嘌呤(A)，而AD1菌株atzA基因的第832位碱基是鸟嘌呤(G)，使得编码产物的第278位氨基酸是甲硫氨酸而不是缬氨酸。自从1983年第1例转基因植物问世以来，转基因植物在农业上得到了广泛的应用，种植面积直线上升。在转基因农作物中，抗除草剂转基因作物的种植面积始终保持在70％以上，2003年达到49.7 mha，占当年转基因作物面积的73％。抗除草剂转基因作物的应用，避免或减轻了除草剂对农作物的伤害，使大规模使用除草剂、大幅度减轻农民的劳动强度成为可能，因此深受农民欢迎，也给公司带来了巨额利润。抗除草剂基因的应用也从最初作为选择标记、农田除草等单一功能有了很大的拓展，产生了重大的经济和社会效益。在抗除草剂转基因研究中，黄大年等在世界上首创转抗除草剂基因杂交水稻，解决了两系杂交稻制种的纯度问题，研究结果被500位院士评为1997年十大科技进展之榜首。南开大学、天津农学院与中国水稻研究所合作，成功地将AD1-atzA基因导入水稻，获得了抗阿特拉津的转基因水稻，为污染土壤的生物修复和atzA基因在杂交稻制种中的应用奠定了基础。然而转基因作物也是一把双刃剑，大规模种植抗除草剂转基因作物使施用除草剂更加无所节制，加剧了土壤、地下水的污染，其结果使本来已经相当脆弱的生态环境雪上加霜。国内外对植物修复被污染环境进行了大量研究，为了有效修复环境，所选的植物不但要能够耐受污染，而且必须根系发达，生长迅速，生物量大。需要指出的是，治理污染农田的目的是农业的可持续发展，因此在污染的农田上大规模种植多年生植物，特别是木本植物是不可取的；同时为了防止外来物种入侵造成新的生态和环境问题，必须慎重选择可以控制的植物。基于上述考虑，用具有抗性的农作物清除土壤中的污染物是理想的途径；利用抗性基因的解毒机制，构建高效去除污染物的转基因农作物，是植物修复污染环境的一个重要方向。Doty等将人体细胞色素P450的转录因子转移到烟草中，转基因烟草分解三氯乙烯的速度比对照高出640倍。Inui等将人CYP1A1基因导入马铃薯也成功地提高了对除草剂的抗性。Bode等用转CYP1A1和CYP1A2烟草的悬浮细胞分解阿特拉津的机理进行了研究。中国十分重视对污染土壤的治理，国家973计划、863计划都设立专项进行研究，并取得了不少成果。中科院地理所陈同斌等发现蕨类作物蜈蚣草对砷有超强富集功能，建立了植物修复示范工程。但是对有机污染土壤的修复研究还鲜有报道。国内在利用抗除草剂基因方面进行了大量研究，但是在利用转基因技术治理有机污染方面还是空白。该项目拟获取转atzA基因烟草工程植株以修复阿特拉津污染农田。烟草是最重要的经济作物之一，适应性强，从北纬60˚到南纬40˚都可种植，中国黑龙江、新疆直到海南都有种植。因此有实际应用的前景。烟草的根系发达，植株生长量大，从土壤中吸收物质的能力很强。此外，烟草的转基因技术成熟，可以得到大量的转基因植株，这为以后选育有高效分解能力、农艺性状良好的株系进入实际应用奠定基础。中国对转基因生物实行严格的安全评估。该研究的设想是安全的。因为烟草原产美洲，中国没有野生烟草，不存在atzA基因向野生烟草转移的危险；目前也没有烟草与其他物种(包括茄科其他属和种)进行远缘杂交的报道，因此也不存在转基因烟草向其他植物转移atzA基因的危险。最重要的是atzA编码阿特拉津氯水解酶，将有毒的阿特拉津脱氯水解为无毒的羟基阿特拉津，因此对人畜是安全的，应用前景十分明朗。但转atzA基因研究也存在一些问题，已有的atzA基因数目太少，全世界仅2个(美国1个，该课题组1个)，因数目限制影响其开发和应用。同时，也影响酶结构和功能研究，从而影响该基因的综合利用。因此分离新的atzA基因、改造现有的2个基因，对植物转基因研究来说具有重要意义，不仅扩大atzA基因数目，便于分析其结构和功能，而且有望获得活力大大提高的新基因，改善植物转基因修复污染土壤的效果。定向进化技术是改造酶活力、底物特异性、蛋白功能等有用的新技术，并在实际中取得了明显效果，进化酶分子的特性比对照提高了数十倍、数百倍、甚至数千倍，最高的报道显示天冬氨酸转运酶催化效率提高了2.1×106倍。其原理是利用DNA重组或复制(或扩增)过程中产生的错误配对，使其碱基位点发生改变或基因内部发生颠倒、缺失、插入或重复，然后通过定向选择在短时间内获取众多需要的新基因、新蛋白、甚至新物种。因此，定向进化技术近年来受到学术界的广泛关注，成为当今自然科学最前沿领域之一，仅Nature (含系列)杂志每年以近100篇(2002年94篇、2003年82篇)的篇幅报道其最新研究成果。定向进化技术中，已报道有许多成熟的DNA随机突变技术。根据突变机理的不同课题组将其分为四大类——基于PCR错配而实现的随机突变、基于DNA同源重组而实现的随机突变、基于非同源重组而实现的随机突变和基于DNA长度改变而实现的随机突变。其中代表性的方法有：本申请人留学研究室开发的“一分子PCR”、Stemmer等人开发的“DNA洗牌”、Cadwell等人开发的“高错误倾向PCR”、Murakami等人开发的“随机插入/缺失突变”等。这些方法所产生的突变类型不完全相同、各有特点，为综合利用构建适合度与丰度相均衡的突变文库、获取最佳特性的进化酶分子提供了组合空间。