[00853359]生物农药羧基吩嗪编码基因的克隆及功能研究

经过一年的努力，课题组已经在大肠杆菌LE392中，利用粘粒pLAFR-5构建了M18基因组文库，从文库中克隆了PCA生物合成的基因簇并完成了该基因簇及其上下游部分片段的基因测序。测序结果表明M18生物合成的结构基因与已经发表的基因簇相比，具有同源性，表明PCA生物合成的结构基因在进化上具有保守性。但是，M18菌株中PCA基因簇在染色体上的分布位置与国际上公布的不同，其上游发现一个修饰基因phzM和一个双元调控系统，可能与PCA的生物合成有关。课题组还克隆了生物合成藤黄绿菌素(Plt)的基因簇，完成了90%以上的测序，BLAST同源对比显示，其核苷酸序列与P.fluorescens Pf-5的Plt生物合成基因簇只在若干个区域同源程度较高，而大部分区域的同源程度都较低。并且在结构基因簇下游存在一个调控基因pltZ。课题组还从基因组中克隆了PCA生物合成调控有关的基因rpoD(s70因子的编码基因)，利用大肠杆菌-荧光假单胞菌穿梭质粒pME6032，将rpoD全长基因置于强启动子tac的控制下，导入M18菌株。发现经质粒转化的M18，在IPTG诱导下，与野生性相比，不仅提前了PCA、Plt的生物合成时间，产量分别提高1倍和6倍。结果表明，在荧光假单胞菌M18中，重组质粒携带的rpoD基因，能以直接或间接的方式增强PCA和Plt编码基因的表达和次生代谢物的生物合成。上述研究成果，为下一步在基因组水平上，开展各种修饰基因和调控基因的突变和改造，研制PCA和Plt高产的基因工程菌株奠定了良好基础。