[00873648]丁二酸高产菌株基因工程改造及其代谢流分析

课题的来源与背景：课题来源：该课题来源于广西自然基金课题“丁二酸高产菌株基因工程改造及其代谢流分析（2013GXNSFBA019102）”。课题背景：丁二酸又称琥珀酸，是一种重要的有机化合物，可作为一种重要的中间化工产品替代苯合成250种以上的化工产品，从而可大大减少苯的使用对环境的污染。可广泛应用染料、医药、香料、农药、食品、油漆、照相和塑料材料工业。全球丁二酸的市场需求量在3万-5万吨/年，预计2020年可达到20万吨/年。但是商品化的丁二酸主要是以石油等资源为原料采用化学法合成，存在以不可再生的石油资源为原料、污染大、成本高、能耗高等确定，而且其在医药、食品、饲料等行业的应用受到限制，严重抑制了丁二酸的发展潜力，不利于其大规模可持续发展。而微生物发酵生物质原料生产丁二酸则可摆脱这一限制，具有原料可以再生而且成本低廉，发酵过程条件温和、能耗低，可节约大量能源，发酵过程绿色环保，可固定大量CO<,2>等优点，成为国内外研究的热点之一。产琥珀酸放线杆菌是众多产丁二酸的微生物中最具工业化潜力的菌株之一，但是存在优良的高产菌株很难获得，发酵过程中丁二酸浓度低、副产物高、发酵成本高等系列问题。技术原理及性能指标：技术原理：该课题在对高产菌株选育的基础上，通过代谢工程手段进行改造，从而获得丁二酸产量高、副产物低的基因工程菌株。性能指标：建立一套筛选丁二酸高产菌株的非定向改造及筛选方法，获得具有自主知识产权的丁二酸高产菌株2株以上；获得的突变株关键限速酶酶活明显提高，副产物含量降低20%以上，探索琥珀酸放线杆菌体内进行基因克隆、表达及基因敲除等基因工程技术的条件，为进一步进行定向改造打下基础；过对获得突变菌株菌株进行发酵条件优化，使丁二酸产量达60g/L以上；发表相关学术论文3篇，其中以第一作者发表国内核心论文1篇，其他课题组成员发表2篇，申请相关国家发明专利1项；培养硕士生1名。技术的创造性与先进性：该课题选育出一株丁二酸产量高、副产物少、性状稳定的突变株GXAS137，该菌株在厌氧条件下发酵48h，丁二酸最高可达38.96g/L。为了进一步提高丁二酸产量、降低副产物，利用代谢工程原理对选育出的高产菌株进行了改造。构建了适合产琥珀酸放线杆菌基因表达的载体pGZRS-E，并对相关基因进行了表达，丁二酸产量最高增加了11.6%；利用基因敲除技术对相关副产物基因进行了敲除，副产物乙酸降低21%。同时对获得工程菌株的发酵条件进行优化，进一步发掘影响丁二酸产量的外部潜力。最后对工程菌株发酵木薯、甘蔗糖蜜、浮萍等非粮作物产丁二酸进行了研究，丁二酸最高可达72.21g/L，为广西生物质产业转型升级提供了技术储备。项目开展过程中发表论文6篇，其中3篇被SCI收录，申请国家发明专利2项，培养博士生1名和硕士生2名。有关产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸的研究主要集中在菌株筛选及发酵条件优化方面，而通过代谢工程改造的研究国内未见报道，因此，该项目处于国内领先水平。技术的成熟程度，适用范围和安全性：该项目的研究成果还处于实验室小试阶段，主要应用于微生物发酵产丁二酸生产，无安全问题。应用情况及存在的问题：主要存在近几年石油价格持续走低，导致生物质能源及生物质材料产品无法与石油基产品竞争，随着石油价格上涨，及进一步选育高产菌株，降低丁二酸生产成本，经过进一步研发和放大研究，该项目将具有良好的经济效益和社会效益。历年获奖情况：该项目尚未获得相关奖项。