[00911091]肿瘤抑制因子Tid1对于JAK2-STAT1信号通路的调控机制研究

课题组将3年研究工作总结如下：1.已经构建和制备不同的肿瘤抑制因子Tid1质粒，并通过测序验证所克隆的质粒的正确性；将质粒转入相应的细胞中，并用免疫印迹实验证明相关质粒可以有效的转入细胞中；2.通过以下实验确定了Tid1和Jak2及Stat1之间的相互作用：通过脉冲追踪实验证明新合成的全长hTid1-L和hTid1-S均可以与Jak2结合，过表达hTid1-L蛋白不影响Stat1701酪氨酸的磷酸化；应用双荧光素酶报告系统检测证实，过量表达hTid1-L和hTid1-S都抑制IFN-γ激活的基因转录；应用凝胶迁移率技术检测实验表明所有的hTid1(包括hTid1-L、-S以及各突变体)过表达并不影响Stat1与基因启动子区域内的激活序列结合；应用构建的U2OS hTid1-LRNAi细胞对VA5细胞(对照RNAi),hTid1-L蛋白水平，不影响用IFN-诱导后Stat1的701位酪氨酸(Stat1Y701)磷酸化水平；应用RNAi技术将U2OS细胞中Tid1-L蛋白敲除，导致细胞对IFN-诱导的基因转录的上升；应用Leptomycin B抑制出核介导物-CRM1(Exportin)与包含出核信号的蛋白(该课题研究为Stat1)的结合，表明，Tid1-L敲除导致的细胞对IFN-诱导的基因转录的上升是由于加快了Stat1的出核；通过跟踪带有绿色荧光蛋白的Stat1-GFP在Leptomycin B处理及未处理时，进一步证明，Tid1-L敲除细胞中，Stat1入核和出核明显加快；以上实验结果表明，细胞中Tid1-L蛋白对于IFN-γ诱导下Stat1蛋白的入核和出核起着调控作用，当Tid1-L蛋白水平下降时，Stat1蛋白出核如何速度明显加快，即Stat1蛋白周转加快，进而导致相应的基因转录增加。3.该课题与临床紧密结合，分析了70例食管癌等临床新鲜组织标本中Tid1及p53，Stat1，Stat3蛋白的表达水平，发现了Tid1,Stat1,Stat3蛋白水平上调非常明显，而p53则显著下降，通过分析不同蛋白在肿瘤组织中表达的差异，有助于课题组寻找到早期诊断肿瘤和预后的标记物。hTid1是果蝇肿瘤抑制因子Tid56的人类同源蛋白,它也是DnaJ家族协同分子伴侣中的一员，主要定位于细胞的线粒体基质中。研究发现hTid1对于IFN-γ激活的Janus蛋白酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)信号通路是一种新的负调控因子，但是其调控的分子机制至今还不确定。该课题将对hTid1如何调控此信号通路的分子机制进行系统研究，确定hTid1调控IFN-γ诱导的Jak2-Stat1信号转导通路的关键结构位点；hTid1对Stat1的磷酸化修饰的影响，尤其是hTid1对Stat1丝氨酸727磷酸化的修饰作用；以及hTid1对Stat1在细胞胞浆和细胞核间的穿梭转运的调控机制。研究结果将为阐明hTid1调控IFN-γ激活的这一重要信号通路的分子机制，进一步明确它在与肿瘤相关的信号通路中的潜在作用，为课题组将来利用hTid1作为一个靶点来治疗肿瘤及开发相关药物奠定基础。