[00917107]食品中沙门菌和志贺菌的双重LAMP检测技术研究

该研究以中国国标中规定必须同时检测的食品中常见病原菌-沙门菌和志贺菌为检测对象，采用LAMP(环介导等温扩增)技术，设计两套引物，在分析其特异性基础上，优化了双重LAMP反应条件，分析了其检测灵敏度，建立了一种能同时检测这两种食源性病原菌的简单、快速的双重LAMP检测试剂盒(方法)，并通过双重PCR进一步验证污染病原菌的种类，相同的研究国内外尚未见报道。1、沙门菌和志贺菌LAMP引物设计及特异性分析：根据沙门菌invA基因和志贺菌ipaH基因序列，应用相关软件设计了引物之间无二聚体形成的两组特异性引物，并对沙门菌和志贺菌的LAMP条件进行了优化。2、沙门菌和志贺菌的双重LAMP检测方法的建立：经过优化确定了沙门菌和志贺菌的双重LAMP最佳反应条件。在该条件下双重LAMP同时检测沙门菌和志贺菌DNA的敏感性为10fg/反应。对人为污染沙门菌和志贺菌的牛奶样品的分析表明，敏感度高达5cfu/10mL样品。3、双重LAMP阳性样品的双重PCR分析：采用双重PCR对双重LAMP阳性样品中的微生物种类进行了判别分析，结果表明，双重PCR对沙门菌和志贺菌DNA的检测灵敏度均为1pg/反应。4、双重LAMP检测方法的应用与评价：对小龙虾样品和人为接种病原菌的牛奶样品，采用双重LAMP、国标和双重PCR分别进行了分析。结果表明，双重LAMP检测结果结合双重PCR对其阳性样品的微生物种类进行判别与国标的分析结果又很好的相关性。5、双重LAMP检测试剂盒的试制与稳定性分析：按照上述双重LAMP-PCR条件，组装试剂盒，并对其稳定性进行了分析，结果显示，在4℃时保存半年、-204℃保存1年后，试剂盒的稳定性基本不变。