[00999953]新型抗肝癌噬菌体单链抗体的制备与应用研究

课题组现在采用的方法，即将肝癌细胞免疫小鼠，提取小鼠脾细胞总RNA，反转录成cDNA，用PCR方法扩增出抗体的全套可变区基因，构建成抗肝癌噬菌体scFv库，或直接从人体B细胞扩增出抗体的全套可变区基因，构建成完全人源的抗肝癌噬菌体scFv库，再通过适当的筛选方法获得特异性的目的scFv。该方法过程简单，应用潜力大。国外Souriau等[5]利用噬菌体抗体库技术筛选出抗表皮生长因子scFv，但至今仍未见用于筛选抗肝癌scFv的研究报道。课题组2001年[6，7]率先在国内外成功构建了库容量为2.14×106的抗肝癌噬菌体scFv库，但由于库容量较小，筛选高质量的scFv尚不理想，因此课题组一直致力于扩建库容量、优化筛选方法等方面展开工作。课题组在2001年构建的抗肝癌噬菌体scFv库基础上，又成功将库容量扩大至5.3×107，并采用集落挖掘法(colonyliftassay)筛选出2株抗肝癌scFv，分别命名为scFvB1和scFv4-16，它们与肝癌细胞Bel-7402结合的滴度比正常肝细胞(L-02)低256倍。免疫组化结果显示：两者都能与肝癌细胞Bel-7402特异结合，但与胃癌细胞、结肠癌细胞无结合活性scFv4-16与60例肝癌组织特异结合的阳性率为41.7％(同样标本AFP的阳性率为56.7％，P>0.05)，与30例胃癌组织、20例食管癌组织、30例结肠癌组织及20例肺癌组织无结合活性。上述结果初步表明，scFvB1和scFv4-16对肝癌具有较强特异性，且识别肝癌抗原的位点和途径与AFP不同，完全有可能成为一种新的肝癌标志物，因此提高其亲和力是课题组亟待解决的重点之一。