[01109804]血红密孔菌液态发酵高效生产胞外漆酶的技术研究

漆酶是一种重要的生物催化剂,能氧化、转化一大类含有苯酚及苯胺的有机物,在环保、食品、有机合成、造纸、染织等领域具有广大的应用前景。本项目从环境产漆酶微生物的筛选、发酵优化、蛋白质鉴定、酶学性质等方面进行了研究,实现了高效漆酶的生产技术。具体内容如下： 1、 从广东省地质公园干枯木头上筛选到一株产胞外漆酶的真菌,经形态学与分子生物学鉴定为血红密孔菌,命名为Pycnoporus sp. SYBC-L3,GenBank登录号为GU182936。 2、 对菌株L3进行了液体发酵优化,确定了优化产酶培养基：麦芽糖 14 g/L,豆粕 6 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L, Na2HPO4 ·12H2O 0.2 g/L, Cu2+1.5 mmol/L, 香兰素 1 mmol/L, Mn2+ 0.2 mmol/L;较优的培养条件为：起始pH值5.0、种龄3天、接种量10%、摇床转速200 r/min。在该培养基和培养条件下,在摇瓶中胞外漆酶的最高活力出现在第8天,为45 U/mL,为优化前的57倍。 3、 以摇瓶优化的培养基和培养条件为基础对-L3在不同规模发酵罐上的产酶水平进行了研究,在所测试的几个发酵罐水平上均取得了较好的酶活产量,其中在50 L搅拌式发酵罐中取得了最高的酶产量,为110 U/mL,在65 L气升式发酵罐中产酶活力达到72 U/mL,在5吨搅拌式发酵罐中产酶最高为80 U/mL。 4、 对发酵罐中所产的粗酶进行了部分性质研究,发现粗酶在0-100℃的范围内均有较高的催化能力,最适温度为55℃,最适pH值为3.5,粗酶具有良好的热稳定性,在不同温度下的半衰期分别为4 h （70℃）、6.5 h （60℃）和10 h （50℃）,室温下粗酶以液体的形式储存一年后依然有80%的活力。对粗酶中包括漆酶在内的主要蛋白质成分进行了分析,发现发酵液中有至少存在13种不同的胞外蛋白质,其中主要组分是三中漆酶同工酶。采用喷雾干燥法将液体粗酶制成了粉剂漆酶,酶活的回收率达到80%左右。 漆酶的高效生产为其在工农业中的应用奠定了基础。未来的研究可对该菌株进行改造,进一步提高产酶效率。