[01117036]固态发酵生产富含黄酮苷元的番石榴叶原料及其降糖食品制造关键技术

本成果课题来源于广东省科技发展专项资金（公益研究与能力建设方向）支持项目。 番石榴叶是一种民间用于降血糖辅助作用的果树叶,含有丰富的多酚、黄酮和萜类以及多糖等活性成分。目前番石榴叶只有茶叶粗制产品,存在降糖效果不稳定、口感差,推广难等问题,严重阻碍了该天然资源的应用发展。研究证明,通过微生物固态发酵,可以促进番石榴叶中天然多酚和黄酮类物质的转化和释放,将一些低活性、不易被人体吸收的黄酮糖苷类物质（如芦丁、槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖苷等）转化为易于吸收的苷元物质（如：槲皮素和山萘酚等）,从而提高其生物活性,包括抗氧化活性和降血糖活性;同时真菌代谢的多糖类物质具有辅助降血糖功能,可增强发酵产品的功效。 1.技术原理及性能指标 本成果采用红曲霉和匹配的益生菌共发酵技术,把番石榴叶中大分子功能成分降解为小分子活性物质,提高具有高降糖活性的槲皮素、山奈酚等苷元的含量。红曲发酵释放的多种酶系,改善番石榴叶的风味,赋予其独特的香味,可开发口感良好的、具有降血糖、抗氧化、提高免疫力等辅助功效的番石榴叶系列发酵食品,包括保健茶和营养餐条等。其中发酵番石榴叶的性能指标如下： 黄酮苷元含量提高5倍,不低于3 g/kg; 多酚含量提高2倍,不低于40 g/kg; 益生菌多糖含量提高1倍,不低于10 g/kg; 控制桔霉素含量不超过0.05 mg/kg（即50ppb）。 从而实现功效提升,包括： （1）降血糖活性提升 发酵后番石榴叶提取物对α-葡萄糖苷酶体外半数抑制浓度（IC50）值,不高于25 μg /mL,抑制效果明显优于临床降糖药物阿卡波糖（178.5 μg /mL）。 （2）抗氧化活性提升 发酵后总多酚的DPPH清除力提升1.5倍,其对DPPH自由基的半数清除浓度由67.38 μg /mL降低至31.98 μg /mL,效果等同VC。当多酚的浓度为0.05 g/kg时,DPPH清除力不低于75%;对ABTS+自由基的半数清除浓度由27.60 μg /mL降至19.64 μg /mL,效力提升1.4倍;对Fe3+的半数还原浓度由92.43 mmolVc/g DM降至52.71 mmolVc/g DM,抗氧化力提升1.7倍。 2.技术的创造性与先进性 （1）构建番石榴叶原料功能活性成分的质量评价方法和标准 以HPLC-ESI-TOF/MS技术为基础,对15种不同产地来源番石榴叶原料进行分析,形成HPLC指纹图谱质量评价方法,该方法有利于后续对不同地区番石榴叶、不同条件发酵转化的活性成分代谢组学分析及特征性指纹图谱构建,筛选合适的番石榴叶作为发酵基质,为对番石榴叶活性成分发酵成熟度调控研究奠定了坚实的基础。 （2）筛选高效转化番石榴叶的益生菌株及建立安全转化体系 从番石榴叶及其种植地土壤中筛选得到高产β-葡萄糖苷酶的番石榴叶转化优势菌株,初步建立了红曲霉菌与枯草杆菌共发酵的高效生物转化体系,实现了混菌体系良好生长,关键酶系高表达,控制番石榴叶降血糖活性成分高效生物转化,并有效消除真菌发酵产生的桔霉素。 （3）明晰番石榴叶功能成分转化并形成高效发酵调控生产工艺 通过番石榴叶原料预处理,复配基质配方,经红曲霉菌与枯草杆菌共发酵炮制,促进黄酮与多酚类物质的释放与转化,使得番石榴叶中总黄酮、总多酚、益生菌多糖的含量显著增加,其中槲皮素作为番石榴叶中降血糖的关键活性物质,含量可达到 3.1mg/g,增长幅度超过200%。同时,总多酚、总黄酮和多糖含量的增长使得番石榴叶的降血糖、抗氧化能力得到显著增强。 （4）构建发酵番石榴叶功能成分鉴别与安全性评价等质量保障体系 构建了HPLC-自由基清除能力检测（HPLC-FRSAD）方法,精准分析番石榴叶降血糖功能成分,对发酵番石榴叶提取物进行体外α-葡萄糖苷酶以及α-麦芽糖酶抑制试验,以及糖尿病动物模型进行实验,评估发酵番石榴叶降糖效果。通过HPLC法测定发酵产品中桔霉素的含量,评估发酵产物应用的安全性。 3.技术的成熟程度,适用范围和安全性 成果采用筛选的益生菌和番石榴叶为主要原料发酵生产,开发出功能、口感适宜的降血糖食品（番石榴叶发酵茶制品,番石榴叶降糖餐条）,健康成分清晰,安全测试合格,形成了规范生产工艺、质量标准、安全性评价、降糖功能性评价等系列文件。本成果技术稳定,已通过中试验证,适用于进入产业化生产,产品可作为辅助降血糖食品,适用于高血糖人群,同时产品的市场化生产推广,可促进番石榴种植产业发展,带领当地农民发家致富。 4.应用情况及产业化前景 成果开发产品可作为普通健康食品应用,如作为保健产品生产销售,需进一步完成保健食品注册及审批工作。同时,融资扩大生产,打通销售渠道,加快产品进入大众市场,以创造更大的经济及社会效益。