[01279768]新型淀粉酶及优良酿酒酵母菌的改造构建

广西是全国最大的木薯种植基地,种植面积超过400万亩,木薯淀粉占全国总产量70%以上。以木薯为原料可年产燃料乙醇2000万吨,产值超过1000亿元,可满足全国燃料乙醇需求并有出口潜力。对缓解石化能源危机和发展广西经济具有重要意义。 目前木薯酒精企业大多以稀醪发酵为主,发酵效率和生产力水平低。厌氧浓醪发酵是燃料乙醇发酵工业中最有效的途径,可提高产量和设备利用率,节能降耗减排。酿酒酵母在浓醪发酵过程中面临着更加严峻的环境胁迫和因甘油、乙酸等副产物增多而降低乙醇得率。选育低副产物合成并具有高抗逆性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵瓶颈的关键所在;另外一个关键因素是淀粉水解酶,淀粉在水解糖化过程中由于液化酶（α-淀粉酶的最适pH为5.5～6.0）和糖化酶（最适pH为4.5）的作用pH不一致,通过基因工程改造获得耐酸耐温的α-淀粉酶,将简化工艺,提高淀粉转化率,降低成本。 本项目基于广西丰富的非粮农作物木薯为原料发酵产酒精的关键技术进行研究,在水解酶和发酵菌种上进行攻关。将耐受环境压力的外源基因（包括酵母转录因子改造）导入酵母基因组稳定表达,以及对酵母乙醇代谢相关的基因进行敲除,选育出发酵速度快的耐高乙醇、耐酸及耐温的优良酵母工程菌株,并在500L中试规模试验,可产乙醇15％（V/V）以上,耐酒精度可达15%以上,耐高糖（＞60%葡萄糖）的酵母菌株。解决普通酵母菌不适浓醪发酵和发酵效率不高的问题。通过运用基因缺失、定点突变和随机突变等技术改造α-淀粉酶基因,构建基因工程菌,发酵生产α-淀粉酶,研制出适于中低温液化、同步糖化发酵的新型耐酸中温（温度70-80°C）的α-淀粉酶产品。形成中试生产工艺,进行中试生产线示范,中试生产取得成果后,可建成年产α-淀粉酶100吨的产业化示范。 本项目来源于广西科学研究与技术开发计划项目,项目于2012年1月下达,项目合同编号：桂科重12118004-4,项目执行期是2012年1月1日至2013年12月31日。本项目的考核指标如下： 研制出适用于低温液化、同步糖化发酵的新型α-淀粉酶,最适反应温度75-85℃,最适pH4.5-5.5,比活力≥27IU/mg;构建出1-2株耐高乙醇（＞15%）、耐高糖（＞60%）、发酵速度快、产酒率高的优良酿酒酵母工程菌株。发酵温度35-37℃,提高乙醇产量2%;在500L发酵罐中试,发酵液中乙醇含量≥15%（v/v）,残总糖含量≤1.0%,残还原糖含量≤0.4%,平均发酵时间小于50h,发酵效率达到92%以上;申请发明专利2项以上。 通过本项目的研究,项目组经过分子改造获得了新型的耐酸中温α-淀粉酶,重组α-淀粉酶的最适反应温度为75℃,最适pH5.5,比活力＞27 IU/mg;项目通过基因敲除和高效表达外源基因构建了抗性提高、副产物降低的酿酒酵母基因工程菌,并在500L发酵罐进行中试生产试验,发酵液中乙醇含量达到15.08％（v/v）（样品处理温度为26℃）,残总糖含量为0.98％,残还原糖含量为0.4％,平均发酵时间为48h,发酵效率达到92.34％;本项目获得授权专利5项。 项目组已获得了具有生产应用潜力的耐酸耐温的中温液化酶和高抗性的酒精酵母。选育的酿酒酵母菌Y49,与安琪酵母进行比较,在酒分、酒分/残糖、酒分/残还原糖、副产物甘油、醋酸、挥发酸等考核指标上均有不错的表现,总体评估优于对比的酵母菌种。该菌株在高温 （37℃） 发酵条件下仍有很高的产酒精能力,是一株很有应用开发潜力的耐高温酒精发酵菌种,在提高原料转化率,节能降耗、提高设备利用率方面发挥作用,将会产生很大的经济和社会效益。建立了木薯淀粉中低温液化同步糖化发酵生产燃料酒精的新工艺,与传统的高温液化糖化（高温105℃喷射液化,95℃液化1-2小时,然后降温至60℃左右部分糖化后发酵）的工艺相比,具有节能省耗、可发酵性糖损失少的优点。