[01382362]基因组学比较分析构建乙醇发酵高产酿酒酵母菌株

(1)建立了异源基因在野生型酿酒酵母菌株的核基因组稳定表达技术平台 由于具有专一性高,可做到定向理性设计,成功几率较高等优势,利用基因工程技术构建高性能的酒精发酵酿酒酵母工业菌株一直是国内外研究的热点。目前,主要采用六种研究策略对酿酒酵母菌株进行基因改造：A、将外源基因通过载体导入菌株细胞进行核外表达;B、将外源基因整合到酿酒酵母的核基因组内表达,主要是利用该菌染色体上数十个非随机分布的δ序列和rDNA 上的100-200 个重复单元作为整合位点;C、基因敲除策略,通过敲除某个（些）基因来显著提高酿酒酵母的酒精产量;D、全转录工程（Global transcription machinery engineering,gTME）策略,指通过对酿酒酵母的转录因子进行改造（突变）来提高菌株的酒精发酵性能,包括提高发酵浓度,拓宽菌株对不同糖分的利用能力等;E、酵母细胞表面工程（yeast cell surface engineering）,主要是针对酿酒酵母向胞外分泌蛋白的能力较差,将外源基因与酵母的表面蛋白基因融合,再加上信号肽序列,使外源基因在细胞表面表达,并通过细胞原有的表面蛋白锚定在细胞表面,由此显著提高表达酶的活力。目前,该技术已用于提高酿酒酵母发酵木薯、玉米、木质纤维材料等底物产乙醇的性能,但效果尚不理想;F、代谢工程（Metabolic Engineering）策略,即通过基因的敲除和表达来改变细胞的代谢流,由此提高酿酒酵母的酒精发酵性能,包括理性代谢工程（Rational metabolic engineering）、逆向代谢工程（ Inverse metabolic engineering ） 和随机代谢战略（ Random engineering strategies）等多种研究技术。这些技术大多利用实验菌株或模式菌株（同源双倍体核型）为研究对象。对于工业菌株,由于其中存在强大的对异源基因的排斥作用,至今尚未见将酿酒酵母的基因工程菌用于工业化生产的成功报道。 本课题通过建立酿酒酵母工业菌株（异源双倍体）的稳定单倍体细胞系,建立了完整的异源基因在酿酒酵母工业菌株的核基因组稳定表达技术平台,成功构建了遗传性状稳定,符合甘蔗糖蜜乙醇发酵和木质纤维水解糖液乙醇发酵,以及工业生产要求的酿酒酵母高产基因工程菌株,提高了酿酒酵母基因工程工业菌株的改造和研究水平,实现了研究技术的创新。 （2）构建了多株符合甘蔗糖蜜酒精和纤维素乙醇发酵的高性能酿酒酵母基因工程工业菌株 目前,国内外尚无成功构建出能够用于乙醇发酵工业生产的酿酒酵母基因工程菌。纵观近20年来对酿酒酵母工业菌株的基因工程改造研究,主要存在三大技术问题：A、缺乏能够承载高产、高效酒精发酵特性的优良受体菌株;B、缺乏系列菌株的全基因组比较分析数据支撑,对目标基因的选定存在一定的盲目性;C、将异源基因导入工业菌株的核基因组中稳定表达尚存在一定的难度。 针对这些技术难题,本课题以比较基因组学研究和基因与酿酒酵母乙醇发酵表型相关研究为基础,通过建立了异源基因在野生型酿酒酵母菌株的核基因组稳定表达技术平台,以耐受性能优越的酿酒酵母MF1001菌株为受体菌株,采用异源基因导入野生型酿酒酵母工业菌株的核基因组稳定表达,性状不同的酿酒酵母菌株之间的同源基因置换等策略,构建了11株乙醇发酵性能显著提高,遗传性状稳定的,符合甘蔗糖蜜乙醇和纤维素水解糖液乙醇发酵要求的酿酒酵母乙醇发酵基因工程菌株,为我区现有甘蔗糖蜜酒精产业的技术提升,以及木质纤维乙醇产业的发展提供了优良的生产菌种。 （3）实现了酿酒酵母基因工程菌株用于乙醇发酵规模工业生产 基于具有专一性高,可做到定向理性设计,成功几率较高等优势,利用基因工程技 术构建高性能的酒精发酵酿酒酵母工业菌株一直是国内外研究的热点。不过,由于受上述技术瓶颈的制约,目前国内外尚无成功构建出能够用于乙醇发酵工业生产的酿酒酵母基因工程菌。本课题不仅成功构建了遗传性状稳定的乙醇发酵高产、高效、高抗酿酒酵母基因工程生产菌株,并成功将基因工程菌株用于大规模的工业生产,技术处于世界领先水平。 （4）实验证实了5个与酿酒酵母乙醇发酵相关的新基因 以乙醇发酵性状不同的酿酒酵母比较基因组学为基础,采用基因置换、敲除等研究策略,课题实验证实了5个与酿酒酵母乙醇发酵相关的新基因,即CDC15、Gal10、PH04、MBP1和GAL3等基因。这些基因在代谢途径上与酿酒酵母的乙醇发酵关联性不大,这些研究目前国内外尚未见报道。