[00376805]黑曲霉B0201生料固态发酵生产单宁酶研究

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC3.1.1.20)，它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶是诱导酶，需在诱导物的诱导下才能产单宁酶。课题组从2006年开始研究单宁酶的发酵生产，选育了产单宁酶的菌种-黑曲霉B0201，研究了固态生料发酵生产单宁酶的工艺，主要开展和完成了以下研究工作：(1)产单宁酶发酵菌种的选育：采用紫外诱变对5株黑曲霉出发菌株进行诱变，成功的选育到一株产单宁酶的黑曲霉高产菌株B0201。诱变选育的菌株较原始出发菌株的活性提高了148％，所选育的菌株遗传性状稳定。(2)单宁酶测定方法研究：采用没食子酸丙酯作为单宁酶酶促反应底物，通过单宁酶水解底物产生的没食子酸与绕丹宁之间生成的色团物质在碱性条件下显色原理，对固态发酵黑曲霉产胞外单宁酶的活性检测，建立起了一种适合固态发酵黑曲霉产胞外单宁酶的酶活检测方法，该方法简单、灵敏、重复性好。(3)产单宁酶的发酵工艺研究及工艺优化：对黑曲霉B0201产单宁酶的发酵培养基组成和培养条件进行研究，在该基础上，优化了发酵工艺条件，得到工业试验规模的工艺条件。比较常规灭菌发酵和生料发酵对黑曲霉B0201利用五倍子固体发酵产单宁酶的影响，发现生料发酵具有高效实用的优势。研究了五倍子生料发酵产单宁酶的条件。(4)单宁酶的分离纯化及酶学性质研究：对黑曲霉B0201发酵产胞外单宁酶的分离提取工艺进行研究，并对其酶学性质进行了研究。经硫酸铵分级沉淀，DEAE-纤维素层析，葡聚糖G-150凝胶柱层析纯化，酶活回收率为28.7％，纯化倍数是18.44，到了纯度较高的单宁酶。对其酶学性质进行了研究。该酶的分子量为58.8KD；最适pH为5.0，在pH4至pH8之间稳定，最适温度为40℃，低于60℃时的热稳定性好，70℃时完全失活。并对以没食子酸丙酯作为底物时的米氏常数、最大反应速率进行了测定。(5)单宁酶转化生产没食子酸的工艺研究：对黑曲霉B0201生产单宁酶催化转化没食子酸工艺进行研究，获得初步的单宁酶转化生产没食子酸的生产工艺。在pH5.0，40℃的条件下催化单宁酸转化生成没食子酸，反应30min，转化率为72%；在pH5.0，40℃的条件下催化五倍子反应300min，五倍子转化为没食子酸的转化率可高达97%。项目得到贵州省工业攻关项目“黑曲霉生料发酵生产单宁酶的工艺优化及工业实验研究(黔科合GY字[2009]3022号)”等项目的支持。