[00894801]腈水合酶的高效重组表达及其产业化应用

腈水合酶是一种重要工业用酶，能够催化水合反应生成高附加值的酰胺化合物，从而被广泛应用于制备医药、农药中间体等精细化工产品等。采用腈水合酶生物法生产酰胺化合物基本上都是采用野生菌细胞，产酶水平较低，亟需创制腈水合酶高效重组表达技术，并将其用于相关产业链的提质和升级，对促进产业持续健康发展具有重要意义。 相关技术问题主要表现在：1)如何获得高催化活性腈水合酶是技术突破的关键，传统方法是从自然界土壤取样分离筛选获得野生产酶菌株，但用这种方式获得高产酶菌株的偶然性很大、成功率极低、酶活力差，且易发生水解副反应产生羧酸杂质；2)野生菌中酶含量很低，难以实现酶蛋白高效表达，而腈水合酶是寡聚酶，通过重组表达虽能提高酶含量，但是易形成包涵体，酶活依然较低；3)腈水合酶是胞内产物，野生菌细胞生长速度较慢，细胞密度较低。重组菌生长速度快，如能实现高密度发酵，并解决发酵产酶过程表达强度难以控制的问题，必能大大提高发酵酶活；4)催化腈水合反应时空产率低、产物浓度不高。 针对上述问题，项目以产学研平台建设为依托，安徽国星生物化学有限公司和安徽瑞邦生物科技有限公司携手浙江大学联合研发，成功突破了腈水合酶的高效重组表达关键技术，并实现了产业化应用，建成了高效、绿色的酶催化生产酰胺类产品的工业化生产体系，技术指标国际领先，节能降耗减排效果显著。1)运用腈水合酶基因保守区域定向挖掘新方法，获得具有高比活、高稳定性的新型腈水合酶Nhase_08；发明了N端短肽融合、核糖体结合位点改造和亚基均衡表达等增强腈水合酶异源表达效率的新方法，构建了产酶水平高、不催化副反应的基因工程专利菌株(E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-Nhase)；2)研制了反馈补料高密度发酵工业规模生产腈水合酶新工艺：运用乳糖自诱导高效表达新策略，解决了寡聚酶发酵产酶过程表达强度难以控制，包涵体较多的问题；提出了溶氧恒定控制法(DO-Stat)反馈补料高溶氧发酵策略，实现高密度发酵生产腈水合酶，显著提高发酵酶活；3)首创了无缓冲盐酶催化转化技术，发明了两次投酶连续补料生产酰胺类产品的新工艺，形成了产物浓度大、时空产率高的酶催化腈水合反应生产技术，实现了吡啶副产物的高值化利用。